주입 다음 구연액을 이식, 증식 및 구형 엘-요식 활성을 가진 기능적 역량을 갖춘 CAR T Cell 제품을 탈리브-er-ating하는 것은 효과적인 입양 면역 요법의 핵심 구성 요소입니다. 예를 들어, 고형 종양에서 CAR T 세포는 고형 종양을 관통할 수 있고 최적의 항원 자극을 받을 수 있지만, 전반적인 이식 및 증식은 사람들에서 방해를 받습니다. 이 접근법의 주요 이점은 말단 분화 또는 소진된 T 세포를 생성하지 않고 CAR T 세포의 품질 또는 분화 상태를 유지할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 T 세포가 그들의 세포 농도 또는 그들의 배양하는 혈관의 표면적에 아주 민감하기 때문에 어려울 수 있습니다. 뿐만 아니라 그들의 신진 대사 요구. 본질적으로 T 세포는 프로세스 내내 행복하게 유지되어야 하며 그렇지 않으면 성장하지 않습니다.
이 절차를 시작하려면 6 웰 문화 요리를 설정합니다. 배양 접시의 우물에서 T 셀 당 3 개의 구슬의 비율로 안티 CD3 CD28 자기 구슬과 혼합하여 신선하거나 냉동 보존 된 기본 인간 T 세포를 활성화합니다. X-Vivo 15 배지에서 T 세포를 배양하여 정상적인 인간 AB 혈청, L-글루타민, he-pees 및 IL2로 보충됩니다.
확장 시 밀리리터당 100만 T 세포의 농도로 T 세포를 활성화한다. 그리고 산소 20%, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 하룻밤 자극 후 활성화 된 T 세포에 렌티 바이러스 슈퍼 나티제를 추가합니다.
3에서 5 사이의 감염의 복합성을 달성하는 데 필요한 초월제의 양을 계산합니다. 동일한 조건을 사용하여 세포를 계속 배양합니다. 셋째 날에는 극저온 보존 세포의 대표적인 알리쿼트(aliquot)를 수집한다.
저온 보존 전에, 부드럽게 파이펫팅과 자기 분리에 의해 자기 구슬을 제거합니다. PBS가 포함된 동결 매체를 0.5%DMSO로 준비합니다. 그리고 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.
다음으로 T 세포를 300배 G에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 PBS의 5 밀리리터를 추가합니다. 세포를 다시 300배 G에서 5분간 원심분리하고 PBS를 폐기합니다.
우리는 차가운 냉동 보존 매체의 1 밀리리터에서 펠란트를 중단합니다. 차가운 냉동 용기에 T 세포를 동결. 그리고 48 시간 동안 영하 80도에 보관하십시오.
그 후, 냉동 된 세포를 액체 질소로 옮춘다. 나머지 T 셀을 PBS의 5밀리리터에 한 번 세척하여 잔류 벡터를 제거합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다.
이어서, PBS를 데산시키고 밀리리터당 500, 000세포의 농도로 T 세포 배양 배지에서 세포 펠란트를 다시 중단한다. T 세포를 45와 9로 설계된 두 배양으로 분할합니다. 인간 CD4 및 CD8에 구슬과 단일 클론 항체를 계산하여 혈류 세포측정에 의해 T 세포를 계산합니다.
생존 성 염료뿐만 아니라. 밀리리터당 500, 000세포의 농도로 유지하도록 격일배기를 재공급한다. 5일째에는 앞서 설명한 대로 5일째에 카운트와 저온보존이 있다.
7일째에는 PBS에서 500, 000셀을 세척합니다. 그리고 형광 활성화 셀 선별 버퍼의 100 마이크로 리터에서 다시 중단. 이어서, 유동 세포형에 의한 형광구 19관용어형으로 면역염색에 의한 CAR 표면 단백질 발현을 검출한다.
9일째에는 앞서 설명한 9개의 문화가 있는 날과 극저온보존. 이 연구에서는 X-Vivo 배양 전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확되는 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정한다. 이 비디오에 설명된 방법을 사용하여 T 세포는 3일 또는 9일 동안 자극되고 확장됩니다.
여기에 도시된 게이팅 전략에 의해 표시된 세포 분화 프로파일은 세포 표면에 발현된 뚜렷한 당단백질의 풍부를 측정하여 분석된다. X-Vivo 문화 에서 시간이 지남에 따라 이펙터 차별화를 향한 점진적인 변화가 보입니다. 항원에 반응하여 CAR T 세포의 이펙터 기능 및 증식 능력이 평가됩니다.
확장되는 세포는 더 긴 기간 동안 광범위하게 배양된 세포보다 기능적으로 우수합니다. 상이한 기간에 수확한 CAR T 세포의 모든 효능의 인간 이종이식 마우스 모델에서 비교된다. 9일 세포는 300만 의 고용량의 완전한 반응으로 용량 의존성 항미주 반응을 나타내며, 500, 000의 저용량에 대한 효능의 상실.
그러나, 일 3 세포는 고용량과 낮은 복용량 모두에서 지속적인 종양 제어를 보였다. 이러한 반응은 마우스의 말초 혈액에서 CAR-T 19의 절대 수와 연관된다. 전반적으로, 이 결과는 CAR T 세포가 일찌기 수확했다는 증거를 제공합니다, 나중에 수확한 그 능가.
이 절차에 따라, 해마 분석과 같은 추가 기능 분석은 산소 소비 또는 스피잇-잇 용량과 같은 신진 대사 특성을 측정하기 위해 수행 될 수있다. 재자극의 몇몇 라운드는 또한 CAR T 세포의 그들의 분화 그리고 지속성에 통찰력을 제공하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 작품을 기초로 사용하여 우리와 다른 연구자들은 문화 과정을 더 축약하기 위한 연구에 종사하고 있습니다.
그것은 또한 다른 암 항 원에 대 한 코어 접근 디자인에서 확장 될 수 있습니다. 렌티바이러스로 작업할 때는 항상 주의를 기울여야 합니다. 그러나 렌티 바이러스가 복제 무능하도록 설계된 경우에도 마찬가지입니다.
