저자는 재단 Leducq (승모판)과 직원은 국립가이 연구에 자금을 지원을 위해 라 공들인 (ANR Specistem을 부여)을 부어 인정합니다.

1. 준비 동물 절차 동물 윤리위원회의 승인을 받아야하고 바이러스에 작업에 대한 제도적 지침을 따르 HuESC 및 / 또는 IPSC (해당되는 경우)뿐만 아니라, 마우스 처리, 마우스 배아를 획득, 마우스 수술을 수행. 시간 제한 교배를 들어, 플러그의 날 배아 일 (E) 0.5 / 0.5 일 후 교미 간주됩니다. <ol><li> 미세 주사 바늘 : 전 자궁 미세 주입 들어, 1 또는 10 μm의 내부 팁 직경이 각각 DNA 나 세포를 주입하는 날카로운과 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝 모양을 얻을 수있는 피펫 풀러 / beveller를 사용하여 유리 피펫 (1.2 mm 외부 직경 붕규산 모세관)을 당깁니다. 초음파 매개 주사의 경우, 사용 35분의 50 μm의 외경 / ID의 팁 1.14 mm/0.53 mm의 내부 / 외부 직경 (OD / ID)를 가지고 멸균 바늘을 사용자 정의. </li><li> 실리콘 가득 배양 접시 : 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 실리콘을 준비합니다. 기입~ 1cm의 탄성 중합체 층을 깨끗한 유리 60mm 직경 페트리 접시. 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 상품 : 절차를 수행하는 동안 사전에 멸균 모든 수술 도구를 유지합니다. </li><li> DNA 준비 : 하나의 튜브에 3 μg의 DNA 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. 다른 튜브에 3 μL의 리포 펙 타민 2000 년 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 두 솔루션을 섞는다. 즉시 사용합니다. </li><li> 셀 준비 : 10 6 세포 현탁액을 준비 / ML DMEM (둘 베코 이글 중간, 높은 포도당과 50 %의 쥐의 혈청). 최종 세포 현탁액의 50 μl의 8 ~ 10 배아 충분하다. </li><li> 준비 염료 : 25 ㎎ / ㎖ DMSO에 녹색 형광 CDCFDA-SE를 사용합니다. -20 ° C에서 20 μL 씩 분주하고 저장을 준비 멸균 생리 식염수 또는 PBS 사용하기 전에 1:100 / 1:200 희석. </li><li> 바이러스 준비 : ~ 10 10 -10 10 TRA의 역가 상용 제 3 세대 PGK-GFP를 발현하는 렌티 바이러스를 사용단위 / ml의 DMEM을 nsducing. 렌티 바이러스의 준비를 위해, Tiscornia 등 알. (14)는 개인 보호 장비를 착용하고 안전하게 사용과 바이러스 처리를 참조하십시오. </li></ol> 예 생체 내 주입에 대한 E9.5과 E10.5 태아의 2. 컬렉션 <ol><li> 배아 일 9.5 또는 10.5에서 임신 한 쥐를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로, 마우스의 흉부 및 복부를 살균. </li><li> 복부를 열고 PBS의 RT에서 자궁 경적을 검색하고 M16 매체와 실리콘으로 채워진 페트리 접시에 두 PBS 세척 후 전송하는 복부 정중선 절개를합니다. </li><li> 자궁의 혈관 측이 아래쪽이되도록 실리콘 층 곤충 핀 자궁 뿔 핀. </li><li> 표면 아래 1mm에 미세 집게와 자궁의 표면과 탈락의 뚜껑을 잘라. </li><li> 부드럽게 탈락의 벽을 확산하여 난황에서 배아를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 37 °에서 배아를 저장; 세포 주입하기 전에 C M16 중간. 주사의 경우, 각 배아는 미리 예열 37 ° C에서 M16 매체로 채워진 실리콘 요리로 전송 </li></ol> 입체 현미경 3. DNA 나 세포 주입 <ol><li> 해밀턴 주사기 뒤쪽에서 유리 피펫을 입력하고 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫을 흔들. </li><li> 미세 주입 홀더에 피펫을 설정; 50 보압 (DNA) 또는 30 (세포) 고전력 증폭기, 300 (세포)에 150 사출 압력 (DNA) 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.2 초 (DNA) 또는 0.5 초 (세포)에 주입 시간을 설정합니다. 이러한 설정은 약간 microinjector과 펫의 종류에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 적절한 배아를 건드리지 않고 난황을 통해 실리콘 아래로 배아를 핀. 마음의 영역을보고 그냥이 지역 위의 주머니를 엽니 다. </li><li> 세포 주입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 배아 주변에 4 개의 핀을 추가합니다. </li><li> (수동으로 설정) 미세 조작기를 사용하여, slowl다만 (그림 1) 주입하는 마음의 영역 위의 심낭 위 45 °의 각도로 y 위치 피펫 팁. </li><li> 관심 영역에 피펫을 이동하고 주사를 트리거합니다. 가능한 한 빨리 피펫을 가져 가라. 확실히 마음이 제대로 DNA / 세포 주입 후 구타되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 4. 배아, 고립 된 마음, 그리고 이식편 문화 <ol><li> 페니실린 / 스트렙토 마이신, 37 ° C에서 미리 예열하고 40 % O 2 산소 보충 25 % M2 매체 75 %의 쥐의 혈청 문화 E9.5의 배아. </li><li> , 25 ㎖ 유리관에 2 ㎖의 배양액을 추가 부드럽게 배아를 추가하고, 튜브에 캡을 나사 결합하기 전에 40 % O 2와 옥시. 회전 또는 (30 회전 / 분)을 흔들어 동안 37 ° C에서 36 시간까지 배양한다. </li><li> 원하는 시점 (예 : 24 시간)에서 첫 번째 드에 의해, 마음을 건드리지 않고, 미세 집게로 조심스럽게 마음을 해부하다배아를 capitating; 마음은 말초 유출 관을 사용하여 잡아 당겨 소비세 쉽다. </li><li> 문화 12 - 웰 플레이트에서 설정 리겔 코팅 인서트 50 % FCS와 DMEM에있는 다른 36 ~ 48 시간 동안 마음입니다. 심장의 문화 (15)의 개선 된 프로토콜에 대한 다이어 &amp; 패터슨 (2013)를 참조하십시오. </li><li> 관심 영역의 이식편을 확인합니다. 예를 들어, 콜라겐 1 형 겔 16에 48 시간의 아트 리오 심실 운하 (AVC)와 문화를 해부하다. </li></ol> 심장 I N 자궁 내 5. 초음파 유도 주사 <ol><li> 초음파 기계 및 microinjector의 설정 : <ol><li> 레일에 40 MHz의 변환기와 미세 주입 설정으로 고해상도 초음파 시스템을 사용합니다. </li><li> 주입 당 69 NL에서 microinjector에 주입 볼륨을 설정합니다. microinjector 프로그래밍을위한 제조 업체의 미세 주입 설명서를 참조하십시오. </li></ol></li><li> microi의 준비njection 설치 및 주입 : <ol><li> microinjector에 유리 마이크로 피펫을 놓습니다. 최대 볼륨까지 흡입에 의해 효율적으로 주입, 첫 번째 코트에게 미네랄 오일과 피펫의 안쪽을 보장합니다. 그 후 바늘 내부에 오일 1 ~ 2 밀리미터를 떠나, 다시 기름을 꺼냅니다. </li><li> 최대 볼륨에 도달 할 때까지 injectate 대기음. 이 끝을 무디게하고 주입을 더욱 어렵게 만들 것으로 바늘 끝으로 모든 표면에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 주입 동안 배아를 함유 자궁 뿔을 안정, 중앙 컷 소 슬릿을 가진 얇은 실리콘 막에 의해 덮여 중간에 구멍이 변경됨 페트리 접시 (2.5 cm 직경)를 사용하고, 절개 사이트 위에 올려 놓으 . 접시의 가장자리에서 점토의 3-4 덩어리를 배치하여 마우스 처리 테이블에 페트리 접시를 안정. </li></ol></li><li> 주입 절차 : <ol><li> 전에 마취하는 (원하는 배아 단계에서) 임신 한 쥐의 복부를 면도SIA는 머리를 제거합니다. 잔여 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 소독 화학 제모 제와 복부를 처리합니다. </li><li> 얼굴에 마스크를 통해 산소 / 이소 플루 란과 임신 마우스를 마취. 절차의 나머지 기간 동안 1.5 % 다음에 초기 마취, 100 % 산소에 3 ~ 5 %의 이소 플루 란을 사용합니다. 마우스가 충분히 부드럽게 발 및 / 또는 꼬리를 집어 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> (37 ° C에서 가열로 설정) 마우스 처리 테이블에 마우스 부정사를 놓고 각막의 탈수를 방지하기 위해 윤활제와 눈을 포함한다. </li><li> 전극에 전극 젤을 적용 및 심박수, 호흡 수, 및 ECG를 모니터링 전극에 발을 테이프. 몸의 온도를 모니터링하기 위해 직장 온도계를 배치합니다. </li><li> 먼저 마우스를 시각화 및 초음파에 의해 배아를 계산하여 임신인지 확인합니다. 복부 초음파 젤을 적용하고 방광 위의 스캔 헤드를 놓습니다. 일관성을 위해, 우선 방광을 시각화방광의 위치에서 시작하여 왼쪽에있는 배아과 오른쪽 자궁 뿔을 계산합니다. 배아 마음이 정상적으로 박동되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스가 임신 한 경우, 점토와 미래 절개 위의 페트리 접시를 놓습니다. 요리는 직접 접촉되도록 약간 복부에 접시를 누릅니다. </li><li> 접시를 제거하고 다시 복부를 소독. 복부 및 복막을 열고, 약 0.75-1 cm 질보다, 1.5 cm 복부 정중선 절개를합니다. 내부 장기에 손상을 피하십시오. </li><li> 집게로 왼쪽 또는 오른쪽 자궁 경적을 외면 화하다, 부드럽게 요리의 실리콘 멤브레인을 당겨, 다시 점토의 요리를 안정. 방지 광범위이 자궁 혈관과 여성 및 / 또는 배아의 조기 사망의 출혈을 일으킬 수 있기 때문에, 잡아 당기거나 조작. </li><li> 배아 주입 된 적절한 기록 유지를 보장하기 위해 다시 배아를 계산합니다. </li><li> U에 초음파 젤을 적용이미지 terine 뿔 마음과 탈수를 방지하기 위해. </li><li> 이미지 최초의 배아를 주입 할 수 있습니다. 배아 심장의 정상적인 박동을 확인하고 태아의 꼬리 - 두개골과 좌우 방향의 기록을 유지. 필요한 경우, 올바른 방향을 확인하기 위해 약간 자궁 뿔의 위치를​​ 변경. 이 어려운 증명하는 경우, 다음 배아로 이동합니다. </li><li> 약간 (그림 3) 심낭의 외부 배아 위의 45 ° 각도로 바늘의 위치를 미세 주사 바늘로 조심스럽게 자궁에 구멍을. 이 아트 리오 심실 홈 (그림 3)을 향해 가리 키도록 심 외막 세포의 표지를 들어, 이미지 네 개의 챔버보기 마음과 바늘을 위치. 각도를 조정해야하는 경우, 바늘을 빼, 및 재배치. 이 바늘을 깰 수 있으므로, 자궁 안쪽에 바늘의 각도를 조정하지 마십시오. 이러한 사지 또는 태반 등의 조직을 천공하지 마십시오. </li><li> 바늘을 이동심낭 벽에 상냥한,하지만 빠른 움직임으로 찔린. 일반적으로, 거기에 약간의 저항이 될 것입니다,하지만 너무 빨리 바늘을 이동하는 바늘 끝은 심장 자체에 구멍을 발생할 수 있습니다. 팁 아트 리오 심실 홈의 심낭 공간에서 생을 마감한다. 심막 출혈의 경우에, 혈액 세포는 흰 눈 형상 패턴으로 표시 될 것이다. 이 경우, 배아를 주입을 중지하고 다른 배아로 이동. </li><li> injectate을 주입한다. 하트 개발에 대한 악영향을 방지하기 위해 심막 공간으로 극대 700 NL 주입한다. 심낭의 약간의 시간적인 부종에 의해 적절한 주사를 모니터링합니다. </li><li> 주입 후, 밖으로 바늘을 뽑아 injectate 여전히 바늘이 조직의 조각에 의해 막힌되지 않았 음을 확인하기 위해 배출 될 수 있음을 확인. </li><li> 이미지 처리 테이블의 위치를​​ 변경하고 다음 배아를 주입. 방지하기 위해 (한 자궁 경적에) 3-4을 최대로하기 위해 주입 된 배아의 수를 유지대향 자궁 경적 제어 배아를 허용하고, 절차가 배아 발달을 방해하지 않았 음을 보장하기 위해 마취를 확장했다. </li><li> 배아의 원하는 번호를 주입 한 후, 여분의 초음파 젤을 제거하고 부드럽게 적절한 위치에 복부에 다시​​ 자궁 경적을 배치합니다. </li><li> 하나의 복막과 복부 근육 봉합 층, 피부에 대한 봉합의 두 번째 레이어를 사용하여 산모의 복부를 닫습니다. </li><li> 진통제의 첫 번째 복용량으로 마우스를 주입한다. 전에 12 시간 간격으로 마취와 세 개의 추가 주사를 끝으로 0.05 ~ 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 15 분 중 하나 주사를 사용합니다. </li><li> 마취를 중단하고 프로 시저의 적절한 복구를 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 주택의 후속 원하는 기간에 대한 개별 케이지에 임신 한 마우스. </li></ol></li></ol>

<ol>
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위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 - E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커?...

이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은​​ 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 4,5 개발되어 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다. 마우스 배아 등의 배아에있는 염료 또는 레트로 바이러스 벡터와 셀 라벨은 심장 개발 6시 세포 계통의 배아 출처에 중요한 정보를 가져왔다. 예를 들어, 고립 된 마음의 체외 배양 한 다음 생체 마우스 태아의 심장 막 공간에 주입 염료는 심 외막 세포와 그 후손 7 레이블로 사용되었다. 그러나, 염료 및 레트로 바이러스 셀 라벨은 대부분 8 더 쉽게 접근 할 수있다 여전히 제대로 개발 기관, 또는 닭의 배아와 초기 마우스 배아에 적용되었습니다. 예외가 전자의 대상으로 쉽게 뇌입니다mbryos 9,10. 이러한 접근 방식은 아직 구타 배아 마우스의 심장에 적용되지 않았습니다. 염료 또는 바이러스에 직접 라벨을 보완하기 위해보다 고급 단계의 마우스 배아와 성인 마우스의 추적 혈통을 수행하는 셀 라벨 접근 방식은 크레 / 훈제 연어 기술을 이용하여 형질 전환 생쥐의 분석과 결합되어 있습니다. 크레 / 훈제 연어 방법 (11)는 그러나 재조합 효소의 발현을 구동하는 데 사용되는 게놈 규제 지역의 시공간 특이성, 그리고 크레 / 훈제 연어 재조합 (12)의 효율성으로 인해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 단지 크레 식을 구동하는 데 사용 규제 지역의 활성화 후 전구체에 레이블을 지정할 수 있습니다 더욱이,이 방법은 완벽하게 세포 운명의 세포 이동 구동 인수의 특정 문제를 해결하지 않습니다. 또한 분명한 윤리적 인 문제에 대해 인간 배아에 적용 할 수 없습니다. 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 새로운 P 시리즈를 디자인의 대상 지역에서 같은 형광 염료, 바이러스 등 shRNAs와 DNA 기반의 셀 라벨 벡터로 유전자 발현 조절 자, 또는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 세포와 같은 세포 라벨링 에이전트의 다양한 주입하는 rotocols 마음. DNA / 세포 주사는 입체 현미경과 48 시간, 또는 48 ~ 72 시간 동안 고립 된 심장이나 배아 이식편 문화까지 생체 배아 문화와 함께 간단한 미세 주입 장치를 사용합니다. 우리는 또한 자궁에 배아의 마음 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을보고합니다.이 기술은 배아 (13)의 개발을 모니터링 할 수 있으며 injectates 및 / 또는 표지 세포의 장기 추적 관찰 할 수 있습니다. 우리는 이러한 접근 방식은 장기의 기능을 보존하고 줄기 세포의 잠재력을 시험 관내 시험보다 더 대표적인 환경을 제공하는 것으로 나타났습니다. 또한, 마이그레이션을 수행 할 수있는 기회를 제공한다자신의 운명을 모니터링하는 세포를 표시 및 / 또는 주입. 궁극적으로, 이것은 지역 티슈 패터닝 및 주요 생물학적 과정의 더 나은 이해를 수득한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 - 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히​​ 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.

상기 주입 프로토콜을 사용하여, 세포를 표지 및 / 또는 마우스 배아 심장에 주입 될 수있다. 개념의 증거로 몇 가지 예는 주입 프로토콜과 생체 AVC 이식편, 고립 된 심장, 또는 전체 배아 문화 (그림 1) 결합 된 표시됩니다. 도 1은 세포 주입 전의 배아의 제조를 나타낸다. 난황 (그림 1A)의 무결성을 유지하면서 E9.5의 배아의 탈락에?...

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Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  Aix-Marseille University.  우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발. 

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...