이 방법을 사용하여 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 심장 관 형성, 루핑 및 전체 챔버 형성을 직접 검사할 수 있습니다. 비록, 우리는 예를 들어 MLC-2v-tdTomato 마우스를 사용하지만, 이 간단한 방법은 널리 다른 형광 기자 마우스 라인과 함께 사용될 수있다. 이 프로토콜의 주요 장점은 매우 간단하며 복잡한 기술이나 장비가 필요하지 않다는 것입니다.
일반 랩 설정에서 수행할 수 있습니다. 남성 마우스와 여성을 짝짓기 후, MLC-2v-tdTomato 8 받는 사람 10 주, 매일 아침 질 플러그댐을 확인. 임신 한 댐을 누워, 다른 일에 안락사 후 coitum, supine 위치에 70 %에탄올로 복부를 스프레이.
날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 피부와 복벽의 절개에 의해 복강을 엽니 다. 복강의 등쪽 에서 양측 자궁 뿔을 찾은 후, 날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 전체를 분리하여 양쪽의 oviducts 위로 조심스럽게 자른다. 해부된 자궁 전체를 얼음 차가운 PBS가 있는 10센티미터 페트리 접시에 놓습니다.
날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 경적을 따라 각 양수 주머니를 조심스럽게 분리하십시오. 핀셋을 사용하여 각 배아를 얼음 차가운 PBS로 채워진 35mm 배양 판으로 옮춥습니다. 날카로운 외과 가위와 집게를 사용하여 양수 주머니를 열고 탯줄을 잘라각 배아를 노출한 다음 배아를 손상시키지 않고 가능한 한 많은 배아 조직을 다듬습니다.
광섬유 현미경 조명기를 가진 해부 현미경의 밑에, 태아의 머리를 잘라 내고 1.5 밀리리터 의 완충 A를 가진 1.5 밀리리터 관으로 전송하는 것은 나중에 지노티핑을 위한 epifluorescent 화상 진찰의 결과와 상관관계를. 미세 한 집게를 사용 하 여 배아의 가슴을 엽니다. 날카로운 수술 가위와 집게로, 폐와 혈관에서 멀리 심장을 제거합니다.
핀셋을 사용하여 해부된 배아 심장을 PBS를 사용하여 35밀리미터 배양 판으로 옮기습니다. 상형광 해부 현미경 아래에 마우스 배아 심혼으로 접시를 놓습니다. 심실개발이 심사관을 마주하고 있는 것과 같은 배아 심혼을 배치하기 위하여 미세한 집게를 사용하십시오.
밝은 필드 모드에서 0.63배의 목표를 사용하여 초점을 조정합니다. 밝은 필드 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. tdTomato 발현을 시각화하려면 광섬유 현미경 조명기를 끄고 적색 형광필터를 설정합니다.
필요한 경우 이미지 의 초점을 재조정하고 밝기와 대비를 조정하고 적색 형광 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. 배아 지노피의 경우 이전에 분리된 헤드 샘플을 완충 A에서 섭씨 100도에서 30분 동안 끓입니다. 11, 360회 G.Transfer 20 마이크로리터에서 버퍼 B와 혼합20 마이크로리터가 있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 2분간 원심분리기를 합니다.
혼합 된 상체체의 4.5 마이크로 리터를 DNA 템플릿으로 사용하고 10 마이크로 몰라 특정 전방 및 반전 프라이머 각각의 0.5 마이크로 리터, 2x pre혼합 폴리머라제 및 반응 버퍼의 10 마이크로 리터와 결합한 다음 총 20 마이크로 리터에 물을 추가하십시오. 원고에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 완성된 반응을 100개의 베이스 페어 DNA 사다리에 1%아가로즈 젤에 적재하고 1x TAE 버퍼에서 25분 동안 140볼트로 실행한다.
완성된 젤을 UV 트랜길루미나이터에 놓고 UV 광을 켜면 DNA 밴드를 식별합니다. MLC-2v는 심장 발달 도중 심실 챔버 사양을 위한 초기 마커로 여겨됩니다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크인 마우스에서, E8.0에서 선형 심장 관에서 tdTomato의 상대적으로 약한 발현은 배아의 전체 마운트 에피플루센트 이미징을 사용하여 나타난 바와 같이 E8.5에서 강해진다.
해부된 심혼의 전체 마운트 에피플로스테센트 이미징을 사용하여 마우스 심장 발달 시 심실 챔버 형성을 쉽게 결정할 수 있습니다. E10.5에서 전체 마우스 배아로부터 해부된 심혼에서 MLC-2v-tdTomato 리포터 발현은 유입로, 유출로 또는 미래의 아트리아가 아닌 심장의 심실 부에서 나타났다. E12.5에서 E13.5까지, tdTomato 리포터는 4챔버 심장의 심실에서 독점적으로 표현됩니다.
유사한 심실 특이적 발현 패턴은 E16.5에서 해부된 마우스 배아에 나타났다. 전체 이미징 후, 배아의 유전자형은 PCR 유전자노티핑을 위한 프라이머 2세트를 사용하여 결정되었으며, tdTomato 노크인 알렐, 이종수구및 야생형 배아를 운반하는 동형제 배아를 확인한다. 이 방법은 매우 간단하고 수행하기 쉽습니다.
중요한 단계는 배아 심혼을 해부하는 것입니다. 심장 발달 도중 심장 해부학을 이해하는 것은 전체 태아에서 심혼을 성공적으로 격리하기 위하여 필요합니다.
