This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

참고 :이 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 캐나다의 가이드에 따라 수행하고, 대학 학자 라발 동물 보호위원회에 의해 승인되었다. 1. 샘플 준비 참고 :이 예제에서, 우리는 출생 후 1 일에서 마우스의 뇌를 사용했다. <ol><li> 3 새끼 분간 4에 대한 분쇄 된 얼음에 저체온 마취를 사용하여, 다음 얼음처럼 차가운 L15 매체에 가능한 한 빨리 뇌를 해부하다. 2 분 내에이 단계를 수행합니다. </li><li> 전송 해부 금형 (물자의 CF. 목록)를 포함 두뇌하고 원하는 위치에 시편의 방향을 돌보는 냉동 조직 내장 미디어를 입력합니다. -80 ° C에서 액체 질소 저장 즉시 시료를 동결. 30 초 이내에이 단계를 수행합니다. 주 : 시험편 RNA의 품질을 손상시키지 않고 몇 달 보관 될 수있다. </li></ol> 2. 단면 <ol><li> 치료 막 COA테드 유리 슬라이드 (CF. 재료의 목록) 표면의 RNAse 오염 제거 솔루션은 RNAses의 흔적을 제거합니다. DEPC 물에 슬라이드를 세척하고 건조 할 수 있습니다. 또한, 하룻밤 200 ° C에서 빵을 슬라이드. </li><li> 이전에 표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 세척 저온 유지 장치에 냉동 샘플을 전송합니다. 10 μm의 두께에서 -20 ° C 슬라이스 표본에서 설정 저온 유지 챔버 온도. 막 코팅 된 슬라이드에 조직 섹션을 수집하고 염색하기 전에 그들에게 건조 10 분을 할 수 있습니다. 또한, 상점은 염색 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드. </li></ol> 염색 솔루션 3. 준비 <ol><li> 바로 실험 개시 전에 모든 솔루션을 준비하고 RNA의 분해를 방지하기 위해 (세정액을 제외한) 모든 염색 용액에서의 RNAse 억제제를 사용한다. </li><li> 완충 용액을 준비합니다. 1 % BSA로 보충 된 RNAse가없는 인산 완충 식염수 (PBS 이루어지는 모든 솔루션의 동일한 완충액 ()를 사용0.2 % 트리톤 (Triton) 및 2 %의 RNAse 억제제). 각 슬라이드를 들어, 완충 용액 400 μL (기본 200 μL와 2 차 항체 200 μL)를 준비합니다. </li><li> 정착액 솔루션을 준비 : 70 % 에탄올을 사용은 -20 ° C로 유지. RNA 추출 수율이 대폭 감소를 피하기 위해 최소 조직 정착 과정을 유지. 주 : 대안 적으로, -20 ° C에 보관 5 % 아세트산 95 % 첨가 에탄올 용액을 사용한다. </li><li> 완충액에 일차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 도파민 뉴런 라벨링, 티로신 히드 록 실라 제 (TH, 레이트 도파민 생산 제한 효소)을 표적으로하는 항체를 사용한다. 짧은 배양 시간을 보상하기 위해 항체의 높은 농도를 사용한다. 1:25 희석 TH 항체를 사용합니다. 참고 : 1000 : 정상적인 면역 프로토콜,이 항체는 하나의 희석에서 하룻밤 배양 강한 신호를 제공합니다. 이 프로토콜에서, 40X 더 정광을 사용짧은 배양 시간으로 인해 에드. 때문에이 방법에 사용되는 항체의 농도에 따라 비특이적 라벨링의 증가를 확인하기 위해서 병렬 표준 면역 염색을 수행한다. </li><li> 완충액에 이차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 100 : 1의 농도로 바이오틴 차 항체를 사용합니다. 주 :이 예에서, 우리는 바이오틴 화 항 - 토끼 항체를 사용 하였다. </li><li> 비 오티 닐화 된 이차 항체의 검출을 위해 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC) 용액을 준비한다. 1의 농도에서 화합물 A와 화합물 B를 첨가하여 ABC​​ 용액 만들기 : DEPC PBS에 희석 (100)는 2 %의 RNAse 억제제가 보충. 슬라이드에 추가하기 전에 아비딘 - 비오틴 복잡한 30 분을 준비합니다. </li></ol> 4. 염색 <ol><li> 빨리 공기 그들을 가볍게 치면 -80 ° C 한번에 하나 또는 두 개의 슬라이드를 해동 (또는 송풍기를 사용하여). 소수성와 서라운드 섹션장벽 펜 및 몇 초 동안 건조 할 수 있습니다. <ol><li> -20 ° C에서 더 이상 5 분 이상 저온 정착 용액에 슬라이드를 넣습니다. 세탁 DEPC PBS 6-8 시간에 슬라이드를 빠르게, 다음 정착액 솔루션의 과잉을 제거 찍어 공중에서 한 번 흔들어. </li><li> DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어 넘기십시오. 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> 깨끗한 선반에 슬라이드 (표면의 RNAse 염액으로 전처리는 RNAses의 흔적을 제거)하고, 실온에서 10 분 동안 각각의 슬라이드 (토끼 항 TH)에 차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 한 번 슬라이드를 쓸어. </li><li> 실온에서 6 분 동안 각각의 슬라이드에 이차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 신속하게 세척 DEPC PBS에서 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어. </li><li> ABC의 솔루 200 μl를 넣어실온에서 4 분 동안 각 슬라이드에 기. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 초과 DEPC PBS를 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어. </li><li> DAB (3,3 &#39;디아 미노) ABC 용액에서 배양의 4 분 동안 솔루션을 준비합니다. 키트 (DAB 퍼 옥시 다제 기판 키트)에서 제공하는 시약을 사용합니다. 제공된 완충액 1 방울, DAB 용액 1 방울 및 DEPC 물 2.5ml의 30 % H 2 O 2 1 방울을 섞는다. 반전시켜 용액을 혼합한다. </li><li> DAB 솔루션의 196 μl를 타고 그냥 슬라이드에 확산하기 전에의 RNAse 억제제 솔루션의 4 μL (2 %)를 추가합니다. 장소 (표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 전처리) 깨끗한 트레이에 슬라이드 및 슬라이드에 DAB 솔루션의 200 μl를 넣어. 참고 : DAB 솔루션 within1 또는 2 분 반응한다. </li><li> 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 무수 에탄올에 몇 초 동안 슬라이드를 넣어. 공기를 쓸어 넘겨 슬라이드를 건조 (또는 송풍기를 사용). &lt;BR /&gt; 참고 : 슬라이드가 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관 또는 LCM 처리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 5. 레이저 캡처 이외에 Microdissection <ol><li> 공기를 쓸어 넘겨 빠르게 슬라이드를 제상 (또는 송풍기를 사용). 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오. </li><li> LCM 진행합니다. 수집 관 뚜껑에 직면 샘플면 현미경 슬라이드를 놓습니다. 샘플에 가장 적합한 배율을 선택합니다. 관심의 세포를 확인하기 위해 초점을 조정합니다. <ol><li> 절단 영역을 정의하고 레이저로 절단 시작합니다. 해부 세포 (RNA 추출 키트) 용해 버퍼의 50 μL 가득 수집 관 뚜껑에 조직의 조각을 수집합니다. LCM하는 단계는 30 분을 초과하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> RNA 추출 키트 (CF. 물질의 목록)를 사용하여 고립 된 세포로부터 전체 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 42 ° C에서 30 분 동안에 수집 된 세포를 품어용균. 예비 상태 조절 완충액 250 μL를 첨가하여 RNA를 정제 용 컬럼. 로드 용균 세포의 에탄올 50 μL. 프리 컨디셔닝 정제 컬럼에 용해 세포의 100 μl를로드합니다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 16,000 XG에서 컬럼을 원심 분리기. 세척 버퍼로 두 번 열을 씻으십시오. RNAse가없는 물을 최소 권장 볼륨 (11 μL)으로 용출 (그것은 bioanalyser 방해 할 수 DEPC로 처리하지 않음). 테스트 품질에 2 μl를 유지합니다. 참고 : 모든 솔루션 및 시약 키트에 제공됩니다. </li></ol></li></ol> 6. cDNA를 합성하고 정량적 RT-PCR <ol><li> 리버스 전사 역전사 효소 및 올리고 (DT)을 이용하여 상보 적 DNA 내로 레이저 캡처 도파민 세포로부터 RNA 샘플. 제조 업체의 프로토콜 (CF. 재료의 목록)을 따릅니다. </li><li> 유전자 특이 프라이머와 QRT-PCR의 증폭 된 cDNA 1 μl를 사용합니다. 설정 PCR 정말이에요정량 PCR을위한 하나의 구성 요소 핫 스타트 반응 믹스 20 μL 부피 ctions는 제조업체에서 권장. 세중 각 반응을 수행하십시오. <ol><li> 여기 기재된 실험을 위해, 다음의 프라이머 쌍을 사용 GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R을 (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG 개그 AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG C​​CT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); TH-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / 목-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> 다음과 같은 빠른 순환 매개 변수를 사용하여 정량적 RT-PCR 증폭을 수행 : 95 ° C를 10 초 45주기 95 ° C, 60 ° C에서 10 초, 72 ° C에서 10 초 뒤에 5 분. determi하는 악기의 기본 설정을 사용하여 융해 곡선 분석을 수행네브라스카 균일 한 제품을 형성합니다. </li><li> 내장 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. <ol><li> 앞서 설명한 바와 같이 14 상대적인 발현 수준을 얻기 위해 두 개의 표준 발현 유전자는 GAPDH 및 Rpl13a의 식 DA 마커 유전자 및 토륨 AADC의 발현 값을 정규화한다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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이 방법의 가장 중요한 점은 RNA 저하를 방지하면서 관심의 세포를 라벨로 구성되어 있습니다. RNAses는 수용액에서 활약하는 바와 같이, 배양 시간을 감소하는 RNA 절약 11, 15을 향상시킨다. 사용되는 모든 솔루션은 RNAses을 비활성화 할 DEPC로 처리해야합니다. 모든 재료 및 표면 RNAses 오염을 방지하기 위해 표면의 RNAse 염액으로 처리 될 필요가있다. 마지막으로, 이러한 조건에서 모든 솔루션?...

뇌는 복잡한 네트워크를 형성하는 다른 신경 세포 유형의 많은 종류로 구성되어있다. 이 신경 세포는 형태, 연결 및 유전자 발현 패턴 (1)에 따라 별개의 그룹과 하위 그룹으로 구성됩니다. 마이크로 어레이를 개발, 차세대 시퀀싱 및 QRT-PCR은 상이한 생물학적 상황에서 1,2- 뉴런 집단의 유전자 발현 프로필을 비교할 수있는 가능성을 제공 하였다. 이러한 민감한 분석 RNA 무결성 2-4을 유지하면서 관심의 세포 유형의 정확한 식별 및 격리가 필요합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기술이 널리 세포 표면 마커 및 / 또는 형태에 따라 특정 유형의 세포를 분리하는데 사용되어왔다. FACS는 공간 해상도 (5)의 전체 손실이 발생하기 전에 정렬에 세포 해리 단계가 필요합니다. 대부분의 신경 세포 개체군은 번째의 해부학 적 분포에 따라 서로 구별된다전자 두뇌입니다. 얇은 뇌 부분에 적용되는 레이저 캡처 미세 절제는 높은 공간 해상도 6-8와 세포의 특정 격리를위한 적절한 옵션을 제공합니다. LCM의 주요 제한은 형태 학적 기준에 유전자 또는 동물 모델에서 설계 형광성 단백질 리포터에 기초하여 관심있는 세포를 식별 할 필요가있다. LCM과 조합하여, RNA의 무결성을 보존 immunolabeling 빠른 방법을 수행하기위한 새로운 기술들의 개발은 현재 유전자 프로파일 실험을 진행하는 세포의 아 집단을 분리한다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 1,9-13 공보에 기재되어있다. 여기서, 우리는 빠른 immunolabeling LCM과 조합함으로써 복합 조직 구조체에서 세포의 특정 서브 세트로부터 고품질의 RNA를 얻기 상세한 절차를 보여준다. 우리는 최대 RNA 회복을 얻기 위해 키 중요한 단계를 수행하고 있으므로 시그마 RNA의 분해를 방지하는 방법을 보여심하게 저 충격 유전자 발현 프로파일 링. 이 프로토콜의 데모를 들어, 하나의 일 된 마우스 중뇌의 도파민 신경 세포의 타겟이되었다. 도파민 뉴런은 티로신 수산화 효소 (TH)에 대해 유도 된 항체, 도파민 합성에 대한 속도 제한 효소를 사용 immunolabeled 수있다. TH 면역 염색 후, 개별 또는 도파민 신경 세포 집단은 LCM을 사용하여 단리 할 수​​있다. Microdissected 세포 용해 완충액에 수집되고, RNA는 RNA 분리 키트를 사용하여 추출한다. 품질과 추출 된 RNA의 양이 bioanalyzer (5)를 사용하여 측정한다. 사용하여 유전자 발현의 추가의 분석 : RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR이어서 2,4,6을 행할 수있다. 예로서, 두 단계 QRT-PCR은 레이저 캡처 절연 도파민 도메인에서 설명된다. 두 도파민 성 신경 세포 마커 유전자의 발현 량의 상대적 정량이 프로토콜의 선택도를 나타낸다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 높은 공간 해상도를 가진 얇은 조직 섹션에서 특정 세포의 분리를 할 수 있습니다. 효과적인 LCM은 이종 조직에서 세포 개체군의 정확한 식별이 필요합니다. LCM에 대한 관심의 세포의 식별은 일반적으로 형태 학적 기준에 형광 단백질 기자 기반으로합니다. LCM 신속한 immunolabeling의 조합은 대안적이고 효율적인 수단은 특정 유형의 세포를 시각화 및 주변 조직에서 그들을 분리를 제공한다. 고품질 RNA는 순수한 세포 집단에서 압축하고 상기 RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR를 포함한 다운 스트림 애플리케이션을 위해 처리 할 수​​있다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 공보에 기재되어있다. 이 글의 목표는 LCM을 사용하여이 특정 세포를 분리하는 RNA의 무결성을 유지하면서 세포 인구의 급속한 immunolabeling을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 여기서, 우리는 설명D immunolabeling 하나 일된 마우스로부터 뇌 조직에서 도파민 성 세포를 포착함으로써 이러한 다단계 절차. 우리는 특별한 배려를받을 자격이 키 중요한 단계를 강조 표시합니다. 이 프로토콜은 관심 조직 및 세포의 종류에 적용될 수있다. 다양한 분야의 연구자 가능성이 방법의 데모에서 도움이 될 것입니다.

이 급속 immunolabeling 절차 RNA 무결성을 유지하면서 원하는 세포를 시각화 할 수있다. 하나는 RNA 추출 전에 티슈 제조하는 단계를 도시한다. 냉동 절편 후, 도파민 뉴런 티로신 수산화에 대항하는 항체를 (표지 된 신경 세포가 갈색에 표시)를 사용하여 표시되어 있습니다. 실험 질문을 따라, 단일 세포 또는 관심의 큰 영역은 LCM을 이용하여 분리 할 수 있습니다 (그림 1D...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K 조회수.  Université Laval.  특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 

비디오: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

연구

생물학

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

바이오 - 래드 총 RNA 키트를 사용 Neuroprecursor 셀에서 RNA 추출

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...