이 방법은 게놈과 더불어 세포 모형 특정 방식으로 얼마나 많은 색채 수정이 통제되는지와 같은 후성 유전학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 표적 세포에서 크롬토닌을 분리한 다음 전형적인 집시 다운스트림을 따를 수 있다는 것입니다. 그래서이 방법은 뉴런 특정 트리밍실에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, lysinc 4, opisoncilly.
그것은 또한 다른 히스톤 수정, 다른 세포 유형 및 기타 모델 유기체에 적용 될 수있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 마리 미토 (Mari Mito)가 될 것입니다. 시작하려면, 작은 조각으로 관심의 조직을 해부 미세 스프링 가위를 사용합니다.
액체 질소로 채워진 깨끗한 용기에 조직 조각을 추가합니다. 그런 다음, 액체 질소로 채워진 2개의 밀리리터 관으로 조직 단편을 전송합니다. 액체 질소를 증발시키기 위해 캡을 열어 5 분 동안 영하 80도에서 튜브를 저장합니다.
차가운 금속 얼음 랙에 조직 샘플을 포함하는 튜브를 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 금속 총알을 넣고 액체 질소로 식힙니다. 차가운 금속 총알을 샘플 튜브 중 하나에 놓습니다.
캡을 닫고 튜브를 극저온 분쇄기의 튜브 홀더에 넣습니다. 즉시 조립된 튜브 홀더를 액체 질소에 1분간 담급드세요. 냉동 튜브 홀더를 극저온 분쇄기의 외부 카세트에 삽입합니다.
그리고 30 초, 60 번 격렬하게 흔들어. 그 후 극저온 분쇄기를 분해하고 금속 탄환을 제거합니다. 그리고 튜브를 미리 차가운 샘플 쿨러에 넣습니다.
쿨러를 음의 섭씨 20도에서 15분간 보관하십시오. 그런 다음 튜브와 파이펫에 1% 포름알데히드의 900 마이크로리터를 첨가하여 혼합합니다. 서스펜션을 1%포름알데히드의 900 마이크로리터가 있는 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기습니다.
다음으로 서스펜션을 섭씨 23도에서 부드러운 회전으로 10분 간 수정합니다. 고정 반응을 중지하려면 튜브에 2.5 개의 어금니 글리신100 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 섭씨 4도에서 5 분 동안 3, 000 배 중력에서 원심 분리기.
이 후, 슈퍼 상복부를 폐기. 튜브와 소용돌이에 PBS 1 밀리리터를 추가하여 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분간 3, 000배 의 중력원심분리기.
이 워시 스텝을 두 번 더 반복하십시오. 다음으로, 혼합펠릿과 파이펫에 500 마이크로리터의 리시스 버퍼 하나를 추가합니다. 튜브를 섭씨 3, 000회에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다.
혼합 펠릿과 소용돌이에 2 의 리시스 버퍼 2의 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오. 그 후, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 무선 면역 침전 분석 아세이 버퍼 800마이크로리터를 펠릿과 파이펫에 첨가하여 혼합한다.
섭씨 4도에서 3, 000배의 중력에서 5분간 서스펜션을 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 다음으로, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 RIPA 버퍼 500마이크로리터를 펠릿에 넣습니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오.
프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼를 추가한 직후, 용양을 초음파 튜브로 옮길 수 있습니다. 그리고 초음파 검사기에 튜브를 배치합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 크로마틴을 전단합니다. 이어서, 샘플을 1.5 밀리리터 단백질 저결합 튜브로 이송한다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 20, 000 배 중력에서 5 분 동안 그것을 분리합니다.
샘플에서 상체를 수집하고 새로운 단백질 낮은 결합 튜브로 전송합니다. 이 프로토콜에서, 탠덤 크로마틴 면역 침전 시퀀싱이 도입되고 입증되었다. 시술 도중, DNA의 질은 다중 단계에서 시험되었습니다.
초음파 처리 직후, 전단 된 DNA는 미세 유체 전기 포세이스 기계로 분리되고 테스트되었습니다. 항플래그 항체 및 항H3K3me3 항체를 사용하여 친화 정화를 수행한 후 DNA 품질을 다시 확인하였다. H2B-FLAG에 DNA의 면역 정화의 특이성은 부정적인 대조군 샘플로 확인되었다.
무시할 수 있는 양의 DNA가 검출된 곳. 프로토콜에 추가하여 시퀀싱 라이브러리의 품질이 확인되었습니다. 성공적인 ChIP 및 T-ChIP는 GAPDH 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 농축 분석을 통해 입증되었습니다.
3개의 신경 유전자를 따라 대표적인 재분배가 얻어졌습니다. 그리고 전체 뇌T-ChIP 추구를 통해 추구하는 뉴런 T-ChIP에 의해 유전자의 다섯 가지 끝에서 읽기의 농축이 관찰되었다. 안정화 후, 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구원들이 쥐의 뉴런에서 세포 유형 특정 히스톤 변형 일반을 탐구하는 길을 열어줍니다.
포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 고무 의류와 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것은 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
