자연 환경 내의 특정 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위해 레이저 포획 마이크로 절제의 힘을 활용하는 것에 대해 생각해 본 적이 있습니까? 여기에서는 마우스 뼈의 극저온 섹션에서 충분한 양의 고품질 RNA를 얻을 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 유전자 조작 된 마우스 모델 이나 질병 모델에서 특정 뼈 세포에서 유전자 발현의 변화를 검사하기위한 훌륭한 도구입니다.
여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 뼈에 초점을 맞추고 있습니다, 그러나 어떤 종에 있는 어떤 단단한 조직의 세포에 있는 유전자 발현을 그자리에서 공부하는 것을 이용될 수 있습니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이, 크리스티안 Schueler 될 것입니다, 내 실험실에서 기술자. 전신 마취하에 생동화에 의해 마우스를 안락사한 후 전체 대퇴골을 빠르게 제거하십시오.
메스와 종이 타월을 사용하여 주변 연조직의 대퇴골을 청소하십시오. 다음으로 최적의 절단 온도 화합물을 포함 금형에 붓고 대퇴골을 포함 금형의 바닥에 놓습니다. 액체 질소로 샘플을 고정스냅합니다.
샘플이 완전히 얼어 붙으면 호일로 싸서 드라이 아이스에 냉동고로 옮춥시다. 추가 처리를 위해 준비될 때까지 영하 80도에서 보관하십시오. 먼저, 저온의 온도를 영하 19도로 설정하고 블록 홀더의 온도를 섭씨 영하 17도로 설정합니다.
다음으로, 70 %에탄올로 극저온의 내부를 닦아. 일회용 블레이드를 단단한 조직, 유리 슬라이드 및 피팅 도구를 냉동저온에 넣고 식히고 단면 동안 극저온 내부에 보관하십시오. 냉동 된 조직 블록을 마른 얼음에 냉동 된 얼음에 냉동 된 얼음으로 옮기고 적어도 10 분 동안 평형할 수 있습니다.
그런 다음 포함 금형의 바닥을 눌러 10월 블록을 금형에서 밀어낸다. 블록 홀더에 충분한 OCT 매체를 적용하여 블록을 부착하고 OCT 매체가 완전히 정지될 때까지 기다립니다. 그런 다음 블록 홀더를 오브젝트 홀더에 놓고 제자리에 조입니다.
블레이드 위치를 조정하고 샘플을 덮는 OCT를 제거하기 위해 15 마이크로미터 절단 증분으로 블록을 다듬습니다. 저온측정기를 조정하여 8마이크로미터 섹션을 생성하고 폐기될 2~3개의 극저온 섹션을 잘라냅니다. 블록에 접착제 필름을 놓고 피팅 도구를 사용하여 필름을 블록에 부착합니다.
이제 필름의 섹션을 유지하면서 천천히 일정한 속도로 절단하십시오. 샘플의 해동을 피하기 위해 극저온바 의 냉동 유리 슬라이드에 미리 냉각 된 유리 슬라이드에 시료를 올려 놓습니다. 테이프를 사용하여 필름을 유리 슬라이드에 고정하여 쉽게 염색할 수 있습니다.
연기 후드에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올, RNase 가 없는 물 및 자일렌의 필요한 솔루션을 얼음 위에 준비합니다. 95%에탄올로 30초 동안 섹션을 배양합니다. 그런 다음 10월을 완전히 제거하기 위해 30초 동안 RNase가 없는 물에 있는 섹션을 조심스럽게 담급니다.
다음으로, 상업용 LCM 냉동 섹션 얼룩 50마이크로리터를 섹션에 디스펜싱하고 실온에서 10초 동안 배양합니다. 슬라이드 가장자리를 흡수성 티슈 페이퍼에 배치하여 단면을 배출합니다. 여분의 얼룩을 제거하기 위해 30 초 동안 100 % 에탄올로 섹션을 헹구는 다.
뼈 부분을 100% 에탄올이 들어 있는 두 번째 튜브에 30초 간 담근 다음 30초 동안 100% 자일렌으로 옮김합니다. 드라이 글래스 슬라이드에 접착제 필름을 지원하여 필름을 가능한 한 평평하게 배치합니다. 그런 다음 필름에 PET 멤브레인 프레임 슬라이드를 놓고 필름에 부착하기 위해 멤브레인에 장갑을 낀 손가락을 짧게 누릅니다.
이 샘플은 멤브레인과 접착제 필름 사이에 끼입니다. 접착 필름은 접히거나 구겨서는 안되며 필름과 멤브레인 사이에 기포가 없어야합니다. 먼저 표면 데폰타미넌트를 사용하여 스테이지 엔드 캡 홀더를 청소합니다.
슬라이드를 슬라이드 홀더에 로드하고 캡을 캡 홀더에 넣습니다. 다음으로 초점을 조정하고 1.25x 목표와 함께 슬라이드 개요를 획득합니다. 40x 목표로 변경하고 포커스를 조정합니다.
슬라이드 개요를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 여기에 표시된 대로 레이저 매개 변수를 조정하여 각 목표에 대해 이러한 매개 변수를 최적화합니다. 레이저가 시료를 자르지 못하면 레이저 전력을 늘립니다.
형태학적 기준에 따라 태아 의 결선 제거제 또는 피질 뼈에서 골세포, 골성 및 뼈 안감 세포를 선택합니다. UV 레이저에 의한 손상을 최소화하기 위해 대상 세포로부터 멀리 떨어진 레이저 경로에 대한 선을 그립니다. 레이저가 시료를 자르지 못하면 레이저를 두 번 이상 적용하거나 불완전한 상처의 반점에 대한 표적을 검사하고 이동 및 절단 옵션을 사용하여 이러한 반점에 있는 조직을 절단하십시오.
별도의 0.5 밀리리터 튜브 캡으로 각 세포 유형을 수집합니다. 먼저 베타 메르카토에탄올을 함유한 리시스 버퍼 50마이크로리터를 수집 튜브의 캡에 분배한다. 1 분 동안 캡에서 위아래로 피펫하여 샘플을 lyse합니다.
다음으로, 용액을 스핀다운하고 베타-메르카토에탄올을 포함하는 용해 버퍼의 00 마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 각 슬라이드에 대해 베타 메르카토에탄올을 함유한 리시스 버퍼350 마이크로리터가 부착된 마이크로센심심분리기 튜브를 준비합니다. LCM 이후에 남은 섹션을 사용하여 RNA를 추출합니다.
필름을 멤브레인에서 조심스럽게 분리하고 리시스 버퍼를 여러 번 섹션으로 천천히 피펫하여 샘플을 lyse합니다. 그런 다음, 드라이 아이스에 lysate 샘플을 넣고 영하 80도에서 저장합니다. 계속 할 준비가되면 실온에서 용재를 해동하십시오.
그 후, 수집 관에서 LCM 수확 된 세포에서 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 리스를 옮기고 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출합니다. 이 연구에서는, LCM 프로토콜은 마우스 대퇴골의 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양의 고품질 RNA를 얻기 위해 개발된다. LCM은 샘플 수집에 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행됩니다.
격리된 RNA의 수율 및 무결성은 마이크로모세피 전기포진을 사용하여 측정되었다. 상이한 용해 프로토콜을 사용하여 얻어진 RNA 품질 및 수량의 차이는 대표적인 겔 및 일렉트로페로그램에서 여기에서 볼 수 있다. 샘플이 1분 동안 캡에서 위아래로 피펫팅하여 분해되면, 미세분분뼈 조직의 1제곱밀리미터에서 약 8.5나노그램의 RNA를 분리할 수 있다.
RIN 값은 8.60입니다. 또는 LCM은 분산형 레이저 펄스를 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 수행되며, 이는 재료를 돌출된 접착제 캡에 투석합니다. 신선한 냉동 뼈의 경우 미세 한 분부 된 뼈 조직의 1 평방 밀리미터에서 약 1.6 나노 그램의 RNA를 분리 할 수 있습니다.
RIN 값은 하나입니다. 결론적으로, 이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 정확한 방식으로 스탠딩 프로토콜을 적용하고, 샌드위치 복합체의 섹션의 완전한 건조를 방지하고, 적절한 LCM 시스템을 사용하고, 세포를 수확하는 데 시간 제한을 초과하지 않는다는 것입니다. 일단 포획된 세포로부터 RNA를 분리하면, RNA 를 추구하여 발현 프로파일링을 위해 RNA를 사용할 수 있다.
마지막으로, 자일렌과 베타-메르카토에탄올은 후드 아래에서 처리해야 하는 유해 물질임을 상기시키고 싶습니다. 또한 액체 질소와 극저온 블레이드를 취급할 때 적절한 예방 조치를 취하십시오.
