이것은 조나 펠루시다 및 렌즈바이러스 유전자 전달의 레이저 천공을 통해 수정마우스 계란에 관심있는 유전자를 전달하기위한 대체적이고 사용하기 쉬운 방법입니다. 마우스 기증자 절차의 레이저 보조 천공은 또한 바이러스 또는 트랜스페이션 시약의 그밖 모형의 입구를 촉진하기 위한 그밖 종의 수정된 계란에 적용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수정 된 마우스 계란의 미세 조작 및 마이크로 주입에 대한 전문 기술이 필요하지 않다는 것입니다.
수정 된 마우스 계란 격리 절차를 시연 하는 페이지 마이어스, NIEHS에서 비교 의학 지점에서 연구 과학자. 표준 프로토콜에 따르면 16~24시간 후 짝짓기 후, 여성 마우스와 질 플러그의 난소 및 혈관을 분리합니다. 모든 조직이 수집되면 각 난소의 암풀라를 찢어 내고 적혈구로 둘러싸인 수정란을 방출하고 적정 세포에 있는 계란을 신선한 M2 배지에 1 x hyaluronidase를 함유한 35mm 접시로 옮겨 실내 온도에서 3~5분 간 배양합니다.
계란을 몇 번 피펫하여 적정 세포를 방출하고, 효소를 씻어 파이펫팅, M2 매체를 포함하는 새로운 35 밀리미터 접시에 계란을 전송합니다. 다음으로, 세척된 계란을 칼륨 심플렉스 최적화 매체 또는 KSOM, 파이펫을 함유한 35mm 접시에 전달하여 남은 M2 배지와 히알루로니다제를 씻어낸다. 그런 다음, 계란을 35밀리미터 의 조직 배양 처리 플레이트로 옮기고 KSOM 50 마이크로리터와 2밀리리터의 디메틸폴리실록산 2밀리리터를 섭씨 37도, 이산화탄소 와 산소 5%, 질소 90%로 옮길 수 있습니다.
계란은 인큐베이터에있는 동안, 설정하고 XYClone 레이저를 보정, 제조 업체의 권고에 따르면. 계란이 준비되면 첫 번째 드롭 플레이트를 레이저 현미경 단계에 배치하고 조나 펠루치다에 수동으로 초점을 맞춥니다. 레이저 LED 조명이 목표를 통해 볼 수 있음을 확인한 후, 현미경 스테이지를 이동하여 LED 레이저로 조나 표적화하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 XYClone 레이저를 250 마이크로초로 설정합니다.
LED 조명 크기를 적절한 크기로 조정하고 레이저로 각 달걀의 조나 펠루시다를 세 번 천공하여 3개의 10마이크로미터 구멍을 생성합니다. 수정된 계란이 15 분 이상 인큐베이터 외부에 보관 할 수 있기 때문에 천공을 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 그런 다음 천포된 달걀을 인큐베이터에 2시간 더 돌려보습니다.
두 번째 인큐베이션이 끝나면 50 마이크로리터 KSOM 드롭을 혼합하지 않고 농축 렌티바이러스 2개의 마이크로리터로 처리합니다. 그리고 계란을 인큐베이터에 4 일 동안 반환합니다. 계란이 blastocysts로 발전한 때, KSOM의 대략 2개의 마이크로리터에 대략 10-15의 태아를 예금하기 위하여 비 외과 태아 전송 장치를 이용합니다.
배아 전이 후 17일 이내에 임신한 마우스가 자연적으로 출산하거나 필요에 따라 제왕절개에 의해 신생아를 모을 수 있도록 한다. 그런 다음, 유전자 전염을 위해 새끼로부터 조직을 수집하여 유전자 발생률을 결정합니다. 분리되고 변형된 마우스 수정란 발달은 매일 현미경으로 확인할 수 있다.
건강하고 치료되지 않은 배아의 60~70%가 3~4일 이내에 배반구체로 발전합니다. 레이저 천포형의 약 47%가 배반성으로 발전하지만, 그 중 85%는 관심있는 송신 유전자를 표현합니다. 조나 얇아레이저를 조준하는 대신, 개발 배아는 그대로 의 이익을 얻을 수 있으며, 렌티바이러스 트랜스듀션에 허용되는 상태를 유지하면서 조나 펠루치다를 캡슐화합니다.
재조합 렌티바이러스와의 트랜스듀션, 신장인자 1A 프로모터로부터 코파포드 GFP를 발현하는 것은 다중 렌티바이러스 통합을 유도하고, 파란색 LED 램프 하에서 GFP의 높은 발현을 유도한다. 이 절차를 시도하는 동안, lentiviruses가 호스트 게놈에 통합하는 기능이 안정된 유전자 전달을 위한 강력한 공구를 만드는 동안, 그러나 무작위 통합은 또한 삽입 돌연변이를 소개할 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 유전학의 필드에 있는 연구원이 생체 내 단백질 생산을 위한 질병의 연구 결과를 위한 형질 전환 동물 모형을 급속하게 개발하는 것을 가능하게 할 수 있었습니다, 또는 기능적인 유전자 연구 결과를 위해.
이 절차에 이어, 면역조직화학과 같은 다른 방법은 다양한 관심 조직에서 유전자 발현의 위치와 범위에 대한 추가 질문에 답하기 위해 트랜스포이드 새끼로부터 분리된 조직 샘플에서 수행될 수 있다. 렌티바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 렌티 바이러스 와 함께 작동하기위한 기관 지침을 따르십시오.
개인 보호복을 착용하고 폐기 전에 모든 폐기물을 오염 제거하십시오.
