이 작품은 JY에 건강 그랜트 5KO8DK085136-02의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 콜론 조직을 얻기 마우스 이론적 근거 및 연구의 목적을 자세히, 동물 실험을 수행 할 수있는 프로토콜 제출 및 동물 연구 감독의 우리의 기관 사무실에 의해 승인되었습니다. <ol><li> 자궁 경부 전위 다음에 흡입 이소 플루 란으로 마우스를 안락사. </li><li> 복부 정중선 절개를 멀리 소장을 철회하고 콜론을 확인합니다. 옆으로 방광과 자궁 (있는 경우)를 후퇴와 치골을 식별하고 직장을 노출 미세 가위로 잘라. </li><li> 대장의 떨어져 직장의 지느러미 장간막을 해부하고 항문에서 맹장에 콜론을 동원하고, 소장에서 대장을 분리를 절개. </li><li> 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 표본을 놓습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 10 ML의 주사기를 입력하고 콜론 OPE를 절단 한 후, 그 내용을 취소 여러 번 루멘 콜론을 플러시N 길이 방향 가위를 사용. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS의 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 콜론을 배치합니다. 콜론은 특정 방향으로 배치 할 필요가 없습니다. 유체가없는 입자상 물질을 취소 할 때까지 PBS를 대체​​하여 대장을 씻으십시오. </li></ol> 사람의 이 조직뿐만 아니라 잠재적 위험과 혜택에 대한 평가를 얻기의 중요성을 자세히 설명, 수술 환자의 인체 조직을 얻을 수있는 프로토콜을 제출하고, 인간 연구 보호 프로그램의 우리의 기관의 사무실에 의해 승인되었습니다. <ol><li> 대장 외과 의사와 연구 협력은 연구를위한 인간의 조직을 얻을 수있을 필요가있다. 인간의 대장 조직을 얻을 수있는 프로토콜 제출 및 기관 검토위원회의 승인을 받아야한다. </li><li> 서면 동의서는 이전의 수술로 환자로부터 얻어진다. </li><li> 의사는 스탠드에 결장 절제술을 수행합니다ARD 패션. 결장 환자에서 제거되면, 시료는 즉시 병리로 이동합니다. 병리학 적 평가를 위해 필요하지 대장 벽의 전층 섹션에서 0.5이 제공되며, 즉시 얼음처럼 차가운 PBS에 배치됩니다. 이 시료는 대장 장간막을 포함하지 않아야하고, 지방의 존재가 소화 과정에 영향을 미칠 것이기 때문에 epiploic 부속기는도 제거해야한다. </li></ol> 2. 상피 세포를 발가 벗기다 <ol><li> 50 ML 원뿔 관에 HBSS 5 ㎜ EDTA (실온) 25 ㎖에서 전체 마우스의 결장을 품어. 15 분 동안 37 ° C의 동요 노천탕 (250 RPM)에서 원뿔 튜브를 놓습니다. 15 분 후, 조심스럽게 액체를 부어 5 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 25 ㎖로 튜브를 리필, 5 씻어 총 반복합니다. 인간의 콜론, 병리학에서 대장 벽의 ½ 인치 스트립을 획득 한 후 네 개의 동일한 크기의 조각으로 가위로 결장을 잘라. 한 50 ML 원뿔 튜브에 조각 두 개를 놓고별도의 50 ML 원뿔 관에 결장 조직의 나머지 두 조각을 배치합니다. 그런 상술 한 바와 같이, HBSS 5 ㎜ EDTA 25 ㎖로 배양 및 세척을 수행합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS의 20 ML에 두 번 콜론을 씻어. </li><li> RPMI-5 20 ㎖, 디스 파제 10 U, 및 콜라게나 D 2000 U (실내 온도)를 포함하는 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 마우스 대장 조직을 놓습니다. 인간의 대장 조직의 경우, 디스 파제와 콜라의 양의 두 배 (20 U의 디스 파제, 4000 U 콜라게나 D)를 사용합니다. </li><li> (수평으로 배치하는 경우, 너무 많은 통기 및 세포 손상이) 수직 방향 37 ° C의 동요 노천탕에서 튜브를 놓습니다. 최대 60 분 동안 250 rpm으로 흔들어. 디스 파제 및 콜라게나 D에 노출 된 후, 대장 조직을 소화하기 시작하고 대장 조직 힘줄보고 시작합니다. 이것은 일반적으로 약 30 분 소요됩니다. 콜론이 모양이되면, 효소에서 콜론을 제거합니다. </li><li> 조직을 파괴하기 위해 위아래로 2-4 회를 각각의 튜브를 흔들어. 피5 분 탁상 원심 분리기 (4 ℃)에서 200 XG에서 조직을 ellet. 조심스럽게 뜨는을 부어 버린다. </li></ol> 3. 근섬유의 분리 및 문화 <ol><li> 10 ㎖의 ACK 용해 완충액 (47 ° C)를 첨가하여 각 펠렛을 재현 탁. 다시 원심 분리기 5 분 (4 ℃) 200 XG에서, 부어 상층 액을 버린다. </li><li> 피펫으로 10 ㎖의 RPMI-5를 추가하여 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> 100 밀리 TC 처리 접시에 10 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액 (5 ㎖)의 절반을 전달합니다. 그런 다음 RPMI-5의 추가 15 ML을 추가합니다. 다른 100mm의 TC 처리 접시에 세포 현탁액의 나머지 5 ㎖로 반복합니다. 하나의 마우스 결장 따라서 두 개의 100mm의 TC 처리 된 요리를 얻을 것입니다. 인간의 대장 조직의 하나 ½ 인치 스트립은 네 개의 100 mm의 TC 처리 된 요리의 총을 얻을 것입니다. </li><li> 37 ° C에서 10 % CO 2 배양기에서 조직 배양 접시를 놓고 배양 조건은 동일 F 아르또는 마우스와 인간의 기본 세포. </li><li> 3 시간 후, 부드럽게 HBSS의 두 가지 변화에 비 부착 세포를 씻어. 파편 부동 부드럽게 씻어해야합니다. 부착 세포는 상피 세포, 대식 세포와 근육 섬유 모세포로 구성된다. 일주일 후 파종 만 분할을 근육 섬유 모세포, 대식 세포와 상피 세포는 첫 번째 통과 후 senesce. 신선한 RPMI-5를 추가하고 세포 배양에서 세포를 성장. </li><li> 세포는 5 분 동안 트립신 처리하여 계대하고 2:1 분할됩니다. </li></ol> 약어 HBSS : 행크의 균형 소금 솔루션, RPMI-5 : 로즈웰 파크 기념 연구소 매체, ACK : 암모늄 - 염화 칼륨, FCS : 태아 혈청, TC 처리 : 조직 배양 처리 솔루션 ACK 용해 버퍼 - (4.15 g NH 4 망할 CIA, 0.5 g의 KHCO 3, 18.6 mg의 나 2 EDTA, 400 ML의 H 2 O, 1 N HCl로 7.2-7.4로 산도를 조정). 필터 steriliz전자에서 0.2 μm의 필터와 매장을 통해 4 ° C. RPMI-5 - (500 ㎖ 만드는 : 454.5 ML RPMI, 25 ㎖의 FCS, 5 ㎖ 200 밀리미터 L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES, 산도 7.4, 5 ㎖를 100 mM의 피루브산 나트륨, 5 ㎖ 100X 펜 연쇄상 구균, PBS 500 ㎖의 50 mM의 B-ME).

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

마우스 또는 인간의 콜론을 사용하면 일반적인 방법은 비슷합니다. 이 기술은 또한 소장에서 근육 섬유 모세포를 분리하는데 사용될 수있다. 1 근육 섬유 모세포의 분리에 대한 구체적인 내용은. 마우스와 2. 인간의 대장은 아래에 설명되어 있습니다. 1. 마우스 콜론 마우스 결장 관개는 결장의 일단에 16 G 포퍼 무딘 엔드 바늘에 4를 부착함으로써 촉진된다...

위장관 기능의 조절은 점막층과 내부 간엽 간의 복잡한 동적 상호 작용을 수반한다. 이러한 상호 작용은 일반적으로 항상성을 유지하는 역할뿐만 아니라 병적 인 조건 1에서 질병 상태의 개발로 이어질 수 있습니다. 근육 섬유 모세포는 점막 재생, 수리 및 섬유증 2를 포함 중요한 위장관 프로세스의 수를 조절하는 세포 모집단을 둘러싼 주변 분비 방식으로 통신 상피 층 바로 아래에 위치 기질 세포의 모집단입니다. 그것이 시츄 근육 섬유 모세포의 차의 많은 특징을 공유하기 때문에 18Co 세포주 널리 근섬유의 기능을 연구하기 위해 사용되었다 인간 결장 근섬유 세포주의 예이다. 이러한 단백질 - 평활근 액틴의 발현 (α-SMA) 및 멘틴뿐만 아니라 수의 표현을 포함이러한 표피 성장 인자 수용체, 또는 라이 소포스 파티 딕산에 3,4위한 수용체로서 세포 표면 수용체. 때문에 이러한 공유 미세 구조 특성뿐만 아니라 생물학적 기능 소재 유사성 18Co 세포주는 염증성 장 질환 또는 대장 암 3,6 많은 질병 상태의 컨텍스트에서 근섬유의 기능을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 그러나, 세포주를 사용하여 고유의 제한 문제가있다. 이러한 성장 속도와 다른 세포 집단의 상호 작용과 세포의 표현형과 생물학적 기능을 변경, 기본 세포에서 세포 라인을 차별화 시간에 유전자형 불안정이 (가) 있습니다. 세포주는 또한 그것의 사용에 큰 제한 사항입니다 GI 미시 (상피, 간질, 혈관 구성 요소)의 일반 구성 요소를 부족합니다. 따라서, 실험 세포주 연구에서 도출 된 결론은 RI를 줄이기 위해 더 검증이 필요합니다오해의 SK. 기본은 근육 섬유 모세포 세포주 7에서 식별 된 실험 결과를 확인하기 위해 인간 및 마우스 결장 조직으로부터 얻을 수있다. 이 방법은 원래 Mahida, 등. 8에 의해 설명하고, 우리의 프로토콜은 마우스와 인간의 대장 9에서 기본 근육 섬유 모세포를 분리하는 데 사용할 수있는 많은 잘 설명 된 기술 중 하나입니다. 결장 질환의 마우스 모델의 경우,이 기술들은 이웃하는 셀과 상호 작용하는 방법을 연구하거나 정상 또는 병리 GI가 10,11 처리 모두에 기여하는 주요 근육 섬유 모세포를 분리하기 위해 사용될 수있다. 이러한 기술은 면역 조직 치유, 섬유증, 및 결장 선종 및 암종의 개발 점막에 기여하는 방법을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 주요 근육 섬유 모세포 또한 양성 (염증성 장 질환, 협착, 게실염) 또는 악성 C의 작동시 절제 한 인간 결장 조직으로부터 얻을 수있다onditions. 인간과 마우스 대장 조직에서 고립 된 차 세포​​는 세포 배양에서 성장 및 통로의 제한된 수에 활용 될 수있다.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

근섬유는 많은 GI 기능에서의 중요한 역할에 대해 상당한 관심을 얻고있다 위장관 (GI) 요로의 기질 세포이다. 여러 근섬유 세포 라인은 체외에서이 세포를 연구하기 위해 상업적으로 사용할 수 있지만, 실험 세포 배양 조건에 노출 된 세포주에서의 연구 결과는 작품의 지나치게 환원 주의적 성격으로 인해 고유의 제한이 있습니다. 일차 근육 섬유 모세포의 사용은 세포주에서 확인 실험 결과를 확인하는 점에서 큰 장점을 제공한다. 동물 모델에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는 더 밀접하게 질병 상태가 연구되고 모방 조건에서 근육 섬유 모세포의 연구를 위해 수 있습니다. 세포가 기저 질환을 가진 환자에서 직접 오기 때문에 인간의 대장 조직에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는, 틀림없이 가장 관련성이 실험 데이터를 제공합니다. 우리는 u가 될 수있는 잘 확립 된 기술을 설명마우스와 인간의 대장 조직 모두에서 기본 근육 섬유 모세포를 분리 tilized. 이 고립 된 세포는 피하 장 근육 섬유 모세포와 일치하는 알파 - 평활근 액틴과 vimentin에 양성하고, 최근 desmin 음수로 특성화되었다. 주요 근섬유 세포는 세포 배양에서 성장 및 통로 한정 이상의 실험 목적을 위해 사용될 수있다.

일단 고립 된, 인간의 기본 근육 섬유 모세포는 세포 배양에서 재배하고 (유로 4까지) 통로의 제한된 수의를 통해 사용할 수 있습니다. 이 세포는 장 피하 근육 섬유 모세포 5,7와 일치 - 평활근 액틴과 vimentin에 긍정적 인 것으로 특징 및 최근 desmin 음 (그림 1A) 있습니다. 또한 특성 별 모양의 형태 (그림 1B)가있다. 주요 근육 섬유 모세포는 세포주에서 확인 실험 결?...

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Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

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Research

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Biology

19.5K 조회수.  UCLA.  근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다. 

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

연구

생물학

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...