비전 건강 연구 네트워크 -이 작품은 건강 연구 (178918), 퐁 드 공들인 엉 상테 퀘벡의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다.

참고 : 남성 C57BL / 6 마​​우스 (5-7주 이전)의 찰스 리버 연구소 인터내셔널 (. 세인트 - 상수, 퀘벡, 캐나다)에서하고 CHU 셍트 - 저스틴 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조작 할 수 있습니다. 마우스 기관지 조직 절편은 상피 세포에 LMPs의 아폽토시스 효과를 조사하는 차 기관지 상피 세포의 좋은 소스를 제공합니다. 이 프로토콜은 LMPs의 시험 관내 생성뿐만 아니라 LMPs 처리 기관지 조직 이식편에 대한 상피 세포 자멸사를 검출하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 1. LMPs 생산 및 특성 참고 : 오염을 방지이 실험에 사용 된 모든 재료는 멸균 또는 멸균되어 있는지 확인하십시오. 달리 언급하지 않는 한, 무균 조건에서 생물 안전 캐비닛에 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 1.1) 자극과 의원의 컬렉션9 <ol><li> 37 ° C의 수욕 천만 CEM T 세포의 분취 량을 해동. 10ml에 희석 예열 된 무 혈청 200 GX 5 분에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기, 예컨대 X-VIVO 같은 조혈 매체. 예열 배지 5ml에 재현 탁하고 세포 상등액을 기음. </li><li> 15 ml의 예열 조혈 같은 X-VIVO와 같은 매체 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 배양기에서 4 일 동안 배양과 (서스펜션 세포) T75 조직 배양 플라스크에 넣고 세포를 전송합니다. </li><li> 사일 후, 100 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 T175 조직 배양 플라스크에 모든 배양액과 세포를 옮긴다. 그들은 2 백만 세포 / ml의 밀도로 성장 될 때까지 동일한 조건에서 약 72 시간 동안 계속하여 배양 된 세포. </li><li> 균등 네 T175 플라스크 각각 포함 된 150 ml의 신선한 매체 세포가 200 만 / ml의 농도로 (약 48 시간 배양)를 재배 할 때까지 세포 배양을 계속 사이에 세포를 분리. </li><li&gt; 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 각 플라스크로부터 세포를 수집하고, 2 백만 / ml의 세포 밀도를 유지하기 위하여, 150 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 새로운 T175 플라스크에 300 × 106 세포를 재현 탁. </li><li> 0.5 ㎍ / ml의 최종 농도로 배지 (2 ㎎ / ㎖로 DMSO에 용해) 티노 마이신 D 첨가하고 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 모든 문화 매체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 세포를 스핀 다운. 15 분 대 세포 파편을 제거하기 위해 1,500 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 50 분 동안 12,000 XG에 250 ml의 병 및 초 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 알약을 수집합니다. </li><li> 워시 50 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 50 ㎖ 튜브에 40ml의 무균 PBS로 펠릿 LMPs이 농후. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 상층 액을 수집; 이는 비히클 대조군으로 사용한다. 1 LMPs 펠렛을 일시 중단㎖의 PBS는 1.5 ml의 멸균 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 분취 매장 절연 LMPs는 -80 ° C에서 (다중 자유 - 해동 사이클을 방지하기 위해). </li></ol> FACS 분석 (4)를 통해 의원 1.2) 특성 <ol><li> 염화칼슘이없이 넥신 버퍼의 두 샘플 1과 다른 준비 : 헤 페스 10 mM의 NaCl을 140 mM의 플러스 마이너스 5 mM의 염화칼슘 2. </li><li> 입자를 제거하기 위해 0.22 μm의 필터를 사용하여 아 넥신 FACS 완충액 시스 유동 유체 필터. </li><li> FACS 튜브에 5 mM의 염화칼슘 2 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μl를 희석. 염화칼슘 2 (음성 대조군)없이 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μL와 다른 튜브를 준비합니다. </li><li> 각각의 튜브에 넥신 - Cy5에 5 μl를 넣고 잘 섞는다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 품어. 각 튜브에서 FACS 시스 유동 유체의 400 μL와 혼합하여 희석함으로써 반응을 정지. </li><li> 7 μm의 계수 BEA의 10 μL (20 구슬)를 추가합니다각 튜브에서 내부 표준으로서 DS 현탁액 절대 수를 얻었다. </li><li> 상대적 크기의 게이트 (FSC-H, PMT E00, 규모 로그인) 및 상대 단위 (SSC-H, PMT (325), 로그 스케일)의 크기 보정 형광 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에 도트 플롯을 설정 1 ㎛ (게이트 1) 7 μm의 (문 2)에서 비즈 게이트를 계산. </li><li> 20,000 카운트 비즈 게이트 2에 도달 할 때까지 신호를 획득함으로써, 도트 플롯 (규모를 기록, PMT 765) 넥신에 대한 설립 게이트 및 FL-4 채널을 사용하여 FSC-H / SSC-H 플롯에 LMPs 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li><li> CaCl2를 포함 넥신 버퍼에 LMPs의 긍정적 인 넥신 이벤트를 결정하고 염화칼슘 2 (음성 대조군)없이 넥신 버퍼에 LMPs의 이벤트를 뺍니다. </li><li> 다음의 식에 기초 의원의 절대 수를 계산 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> MP P 1.3) 결정rotein 농도 (브래드 포드 분석) <ol><li> 1.25 ~ 20 ㎍ / ml의에서 단백질 표준의 5 연속 희석을 준비합니다. 피펫 중복에 깨끗한 시험관에 각각의 표준 시료 용액 800 μL. 각각의 튜브에 브래드 포드 염색 시약 200 μl를 추가합니다. 믹스 그럼 5 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준 곡선의 선형 회귀를 이용 LMPs의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 2. 기관지 조직 외식 및 LMPs 치료 참고 : 멸균 작업 환경에 특별한주의를 지불하고, 무균 실험을 다음에 사용되는 솔루션과 매체를 준비합니다. , 완전한 치유 미디어를 준비 100ml의 조직 치유 중간 (얼음 해동) 혈청과 조직 치유 중간 보충 교재의 1를 가하여 잘 혼합합니다. 기관지 조직 외식 2.1) 준비 <ol><li> 배양 전에 1cm 2의 6 영역에 흠집메스 블레이드 각각 100mm 조직 배양 접시 표면의 가장자리에 각각. 코트는 각각 배양 접시에 코팅 용액 2 ㎖와 100mm 조직 배양 접시 긁힌, 37 ° C에서 / 가습 CO 2 인큐베이터 O에서 N을 접시를 품어. 진공 잉여 솔루션을 기음과 조직 세척 매체의 15 ml로 접시를 채운다. </li><li> 동물 관리 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 공동으로 2 흡입 (5~7주 세) C57BL / 6 마우스를 안락사. </li><li> 무균는 메스, 뒤몽 초 고화질 트위터, 수술 가위로 폐 조직을 해부하다. 조심스럽게 실질 조직과 혈관을 제거합니다. 해당되는 경우, 실험실로 전송을 위해 얼음처럼 차가운 조직 세탁기 중간에 폐 조직을 놓습니다. </li><li> 또한 티슈 세척 매체에 잠긴 해부 기관지 폐 및 말초 조직으로부터 1~2.5 mm의 직경을 분리 기관지. 메스와 ~ 5mm 두께의 기관지 반지에 조각 기관지 조직. </li&gt; <li> 기관지 조각을 픽업하여 요리의 긁힌 부분에 그들을 배치 할 멸균 곡선 microdissecting의 집게로 떠 모션을 사용합니다. </li><li> 조직 세탁기 매체를 제거하고, 그들에게 요리를 준수 할 수 있도록 ~ 5 분 동안 실온에서 조각을 배양한다. </li><li> 각각의 요리에 완전 치유 중간의 10 ML을 추가 및 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에 배치합니다. 높은 O 2 가스 혼합물 (70 % O 2, 25 % N 2와 5 % CO 2)와 챔버 플러시. 벤치 탑 궤도 인큐베이터에있는 챔버를 놓고 37 ℃에서 흔들어. 매체를 통해 단편 간헐적 흐르게 분당 10 사이클에서 24 시간 동안 흔들어 챔버. </li><li> 24 시간 배양 후, 도립 위상차 광학 현미경 하에서 조직 절편을 관찰한다. 이후 LMPs 치료 완료, 좋은 머리의 움직임과 활기찬 기관지 상피 세포와 기관지 외식을 선택합니다. </li></ol>2.2) LMPs 치료 <ol><li> 다음과 같이 완전한 성장 매체를 준비 : 해동 성장 매체 보충제를 얼음에 혈청 및 섬유 아세포 억제제. 혈청 성장 배지 100 ㎖에 200 μL 억제제 섬유 아세포 성장 배지 보충제 1 ml의 추가; 잘 혼합. 사용하기 전에 10 분 동안 37 ° C에서 완전 성장 배지를 따뜻하게. </li><li> 800 ㎍ / ml의 농도로 LMPs 스톡을 제조 PBS로 새로운 멸균 에펜 도르프 튜브에 절연 LMPs 희석. </li><li> 12- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 전체 성장 배지 0.5 ㎖의 추가. </li><li> 조직 배양 플레이트의 각 웰에 이전 프로토콜 (2.1)에서 곡선 microdissecting 집게로 선택한 기관지 외식을 전송합니다. </li><li> LMPs 처리 우물과 제어 우물을 식별하기 위해 적절하게 배양 플레이트 레이블. 25 μL 제어 차량 (40 ㎍ / ml의 최종 농도)도 각각 LMPs 처리에 25 μL LMPs 주식을 추가합니다 (LMP<html> 대조군 웰의 생산). </li><li> 부드러운 흔들림와 37 ° C에서 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에서 배양을 계속합니다. </li><li> 24 시간 후, PBS로 절편을 3 회 세척하고 다음 단계 (4 % 파라 포름 알데히드 [PFA] 고정)를 진행합니다. </li></ol> 3. 조직 병리학 적 검사 3.1) 다음 단계로 진행하기 전에 다음 솔루션을 준비 <ol><li> 137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.76 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4을 혼합하여 1X PBS 버퍼를 준비합니다. </li><li> 4 % PFA가 교반하면서 60 ℃에서 가열하고, 물 400 ㎖, PFA에서의 20g을 용해 제조하는 단계; 솔루션을 취소 10 M NaOH를 몇 방울을 추가합니다. 다음 1X PBS 버퍼를 추가하고 7.4에 500 ml의 부피와 산도를 조정합니다. 필터와 나누어지는; -20 ° C에서 저장합니다. </li><li> 다음 탈수 나 수분 보충 시약을 준비; 100 %, 90 %, 70 %, 50 % 에탄올, 크실렌. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) 이식편을 고정하고 조직 섹션 탈 파라핀 <ol><li> 4 % PFA 1.5 ml로 표시 microcentrifuge 관의 각 절편을 넣고 4 ℃에서 O / N을 배양한다. 1X PBS로 두 번 외식을 씻어. </li><li> 알코올 일련 이식편 탈수 (70 % 에탄올 : 각 3 회 30 분간, 90 % 에탄올 : 각 2 회 30 분 100 % 에탄올을 3 회 30 분 각 후 크실렌 : 3 회 20 분 각). 흄 후드에서 실온에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 오븐에서 58 ° C에서 파​​라핀 조직 절편을 임베드. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 조직 섹션을 준비합니다. </li><li> 56 ° C의 물을 욕조에 섹션을 플로트 한 다음 표시된 조직 학적 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 1 시간 동안 65 ° C에서 수동 염색 랙 및 건조에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 실온에서 냉각시킵니다. </li><li> 파라핀을 제거하기 위해 10 분마다 자일 렌을 포함하는 4 연속 얼룩 요리 랙을 찍어. 셀만 후 100 %, 95 % : 크실렌을 제거하는 에탄올 시리즈 랙을 찍어다음, 80 %, 70 %,이어서 50 % 에탄올 (단계마다 5 분간) KO. 에탄올을 제거하는 5 분 동안 수돗물 랙을 씻어. </li></ol> 3.3) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 <ol><li> 고정 된 조직 섹션 작업을 계속; 15 분 동안 마이어의 헤 마톡 실린 가득 염색 접시에 선반을 두십시오. 20 분 동안 헤 마톡 실린을 제거하기 위해 수돗물로 랙을 씻어. </li><li> 30 초 95 % 에탄올 30 sec.Place 증류수에 놓습니다. 1 분 동안 에오신 Y 솔루션 염색 접시에 놓습니다. 2 분마다 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌이 변화를 통해 탈수. </li><li> 초과 에오신가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 빠른 검사를 수행합니다. 커버 유리 커버 한 후, 각각의 슬라이드에 장착 중간 (피셔 SP15-100)의 2 ~ 3 방울을 놓습니다. </li></ol> 3.4) 현장 세포 죽음 검출 : TUNEL 분석 실험 <ol><li> 시작하기 전에, 단백질 분해 효소 K 작업 용액을 제조 : 20 ㎍ / ㎖의에10 mM 트리스 / 염산, pH가 7.4. </li><li> 3.2 절 (이식편 고정 및 조직 섹션 탈 파라핀)의 5 단계 1을 반복합니다. 탈의 H 2 O와 슬라이드를 씻어 </li><li> 10 분 동안 1X PBS로 슬라이드를 담근다. 초과 PBS를 배출합니다. 프로 테이나 제 K 작업 용액으로 RT에서 30 분 동안 조직 섹션을 인큐베이션. 린스는 1X PBS로 두 번 슬라이드. </li><li> 세포 죽음 탐지 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 TUNEL 분석을 수행한다. 설치 매체를 이용하여 장착하고 커버 글라스 수동으로 커버 슬립. </li><li> 광학 현미경 샘플을 분석 할 수 있습니다. 갈색 색상의 사멸 세포를 분석하는 프로 이미지 4.5을 ​​사용합니다. </li></ol>

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의원 간 크로스 토크의 활성 매개체 및 그들의 연구는 과학의 많은 분야에서 유망된다. (11)이 연구는 사멸의 T 세포주의 시험 관내 LMPs 대규모 생성을위한 상세한 프로토콜을 제시 하였다. 이러한 의원 림프구 분자의 큰 레퍼토리를 발현과 생물학적 세포 및 조직의 항상성 조절에 연루되어있다. 그러나, 서로 다른 소스에서 파생 된 LMPs 생물학적 다를 수 있습니다. 4,9,12,13 LMPs는 시험관 내에서 이들을 생성하는 데 자극 및 이들이 유래 된 세포에 따라 다양한 특성을 표시. 이와 같이, 생체 내에서 생성 된 데이터 LMPs 불멸화 세포주로부터 유래 LMPs를 이용한 시험 관내에서 얻어진 데이터를 외삽주의하여 수행되어야한다. 이 프로토콜은 의원의 분리를 위해 필요한 여러 원심 분리 단계를 설명한다; 따라서, Careful 조작이 과정 의원의 손실을 최소화하기 위해 필요하다. -70 ° C에서 고립 LMPs의 스냅 동결을 권장하며 우리는 이러한 조건에서 LMPs의 생리 활성이 최대 2 년 (게시되지 않은 데이터)에 대한 보존 될 수 있음을 발견했다. 현재까지, 유동 세포 계측법 의원 분석을위한 &quot;금 표준&quot;으로 간주됩니다. 다색 유세포 분석은 상이한 기원의 세포 개체군의 MP를 결정하는데 사용된다. 그럼에도 불구하고, 현재 시판 유동 세포 계측기는 작은 크기의 의원 인구 (300 nm 미만)을 분석하고 세포 파편 및 MP들 사이를 구별 할 수있는 능력이 제한되어있다. 또한, FACS 분석 (분석 cytofluorimetric) 통계 분석 사멸 세포를 계산하는 TUNEL 분석 방법에 대한 대안 일 수있다. 여기서는 생체 EX 기관지 이식편 배양 F는기도 상피 세포의 우수한 공급원을 제공 할 수 있음을 보여또는 약리 및 독성 검사. 이러한 기관지 이식편 원래 생리적 환경과 유사하기 때문에, 그들은 특정 기관지 또는 폐 질환의 신호 전달 경로를 결정하는 데 유용 할 수있다. 그러나, 수없는 LMPs 상피 세포의 세포 사멸 효과를 확인하는 데에만 기관지 이식편을 사용 또는 / 및 보조 거주자로부터 면역 세포의 활성화에 직접 기인한다. LMPs의 직접적 영향을 조사하기 위해, 기본기도 상피 세포는이 목적에 적합 할 것이다.

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.1 MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane&#8211;derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.6
The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.7 We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,8 which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation. 
The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

<table><tbody><tr><td>LMPs production and characterization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM T cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 medium&amp;nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Flask T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Flask T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&amp;nbsp;D&amp;nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&amp;nbsp;</td><td>559933</td><td></td></tr><tr><td>FACS flow solution</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microbeads (1 &amp;micro;m)</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Polysterene counting beads (7 &amp;micro;m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene FACS tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipet</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipet</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml conical polypropylene micro tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical polypropylene tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical polypropylene tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml high speed polypropylene copolymer tube</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml high speed polypropylene bottle</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay (Bradford assay)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay standard II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Test tube 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Test tube 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubator&amp;nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Low speed centrifuge</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>High speed centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>High speed rotor for 250ml bottle</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>High speed rotor for 50ml tube</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Fow cytometry&amp;nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Bronchial tissue explants and sections&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mice (5-7 weeks old)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Airway PrimaCell&amp;trade; System:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Fine Science Tools Inc.&amp;nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>phase-contrast inverted microscope</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>high O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas mixture&amp;nbsp;</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modular incubator chamber</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 incubated orbital shaker</td><td>Barnstead Lab-Line,&amp;nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture plate</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tissue culture dishes (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools Inc.&amp;nbsp;</td><td>14060-09</td><td>Straight, sharp, 9cm longth</td></tr><tr><td>Half-curved Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools Inc.&amp;nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>humidified CO2 incubator</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&amp;nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Histopathological examination&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formalin formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>paraffin</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp; International, Inc.</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>ethyl alcohol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;glutaraldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp; International, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&#039;s hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>MHS16</td><td>Funnel with filter paper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp; International, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Funnel with filter paper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&amp;trade; Mounting Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24&amp;times;24&amp;nbsp;#1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL detection kit</td><td>In Situ Cell Death Detection, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>oven</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>rotary Microtome</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>staining dish complete</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>including dish, rack, cover</td></tr><tr><td>1.5 ml eppendorf tube</td><td>Sarstedt Inc.&amp;nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Orbital and Reciprocating Water Bath</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>fume hood</td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of lymphocytic microparticles and detection of their proapoptotic effect on airway epithelial cells

세포 간 통신 세포막 유래 소체의 생물학적 역할에 대한 관심이 최근 증가하고있다. 미세 입자 (의원) 1 ㎛, 0.1 ㎛의 범위에서 직경이, 소체의 하나의 이러한 유형이며, 통상적으로 활성화 또는 사멸을 겪는 진핵 세포의 세포막에서 나타냈다. 여기에서 우리는 D. LMPs는 다단계 차동 원심 분리 과정을 통해 고립되고 유동 세포 계측법하여 특성화 티노 마이신 자극 세포 사멸 CEM T 세포에서 T 림프구에서 유래 미세 입자 (LMPs)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 마우스 호흡기 차 기관지 조직 이식편 유래의 기관지 상피 세포에서의 아폽토시스 LMPs 효과를 입증하기위한 인 시츄 세포 사멸 검출 방법을 제안한다. 여기에 설명 된 방법은 체외에서 세포 사멸 림프구에서 LMPs의 풍부한 수량을 분리하기위한 재현 과정을 제공합니다. LMPs 유도이와 같이 각종 질병 모델의 특성을 평가하는 데 사용되며, 약리학 및 독성학 테스트 할 수있다. 기도 상피는 외부 환경과 하부 조직 사이의 보호 물리적 및 기능적 장벽을 제공 감안할 기관지 조직 이식편보다는 불멸화 상피 세포주를 사용기도 관 조직을 요구 수사 효과적인 모델을 제공한다.

LMPs 형광 활성화 셀 (FACS) 분석을 정렬 및 의원 (≤1 μm의)의 97 %가 넥신-V-Cy5에 긍정적 된 1 μm의 구슬 사용 정문에 의해 넥신 V 염색 (10) 특성화되었다 (그림 1A 및 1B). 일반적 LMPs 약 2.5 mg을이 프로토콜 다음 얻었다. C57BL 기관지 조직 이식편은 / 6 마​​우스는 비히클 및 LMPs 처리를 실시 하였다. 기관지 섹션의 조직 병리학 적 분석은 기관지 상피 세포의 구조적 무결성에 LMPs의 효과를 한 것으로 밝혀졌습니다. 제어 외식에서 기관지 상피 세포 (그림 2A) 크게 손상되지 않은이었다; 그러나 LMPs 처리 이식편에서, 표면 상피 세포층이 손상되거나 손실 및 상피 세포 밀도 및 높이 (도 2B)에서 상당한 감소가 있었다 하였다. TUNEL 양성 염색 (세포 사멸의 마커)를 더 제어에 비해 LMPs 처리 기관지 상피 세포에서 발음되었다 ( <strong&gt; 그림 3). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52651/52651fig1.jpg" /> CEM T 세포 라인에서 파생 된 의원의 세포 계측법 분석 그림 1. 흐름. (A) 앞으로 (FSC)와 측면 산란 (SSC) 게이트 의원에 사용되는 1 μm의 구슬과 특성의 결정을. 의원 게이트의 이벤트가 더 전자 노이즈에 해당 이벤트를 구별하기 넥신 V-Cy5에와 라벨링에 대한 평가 하였다 (B) 하여 의원 검출의 특이성을 증가시킬 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52651/52651fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52651/52651fig2.jpg" /> 그림 2. 기관지 상피 층의 손상을 LMPs은 유도. 기관지 epitheli의 대표 조직 병리학 적 이미지를(A) 대조군 또는 (B) LMPs (24 시간 동안 40 ㎍ / ㎖)로 처리 이식편의 음. 이식편 절편을 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색 하였다. 검은 색 화살표는 상피 층을 가리 킵니다. 표면과 기저 세포층 고르지 손실 LMPs 처리 기관지 이식편 (B)의 부분에서 명백하다. 배율 400 배, 바 = 20 μm의은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52651/52651fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52651/52651fig3.jpg" /> 그림 3. 기관지 상피 세포 사멸을 LMPs는 유도 분절 기관지의 상피 층에서 사멸 세포에 TUNEL 분석에 의해 발견되었다.; 긍정적으로 염색 된 세포가 갈색에 묘사되어있다. 제어 기관지 상피 세포의 대표적인 이미지 (A) </strong&gt;와 LMPs 투여군 (B)가 표시됩니다. 검은 색 화살표는 상피 층을 가리 킵니다. 배율 200 배 (상단 패널) 및 400X (하단 패널), 바 = 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52651/52651fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

세포막 창 고 미립자 (의원) 절연 및 병태 생리 학적 효과는 다양한 모델에서 조사 할 수있는 활성 생물학적 소포입니다. 여기에서 우리는 T 림프구 (LMPs)에서 파생 된 의원을 생성하고기도 상피 세포에 자신의 아폽토시스 효과를 입증하는 방법을 설명합니다.

기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K 조회수.  University of Montréal.  세포막 창 고 미립자 (의원) 절연 및 병태 생리 학적 효과는 다양한 모델에서 조사 할 수있는 활성 생물학적 소포입니다. 여기에서 우리는 T 림프구 (LMPs)에서 파생 된 의원을 생성하고기도 상피 세포에 자신의 아폽토시스 효과를 입증하는 방법을 설명합니다. 

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

연구

생체공학

Generating 3D Spheres and 2D Air-Liquid Interface Cultures of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Type 2 Alveolar Epithelial Cells

In the lung, the alveolar epithelium is a physical barrier from environmental stimuli and plays an essential role in homeostasis and disease. Type 2 alveolar epithelial cells (AT2s) are the facultative progenitors of the distal lung epithelium. Dysfunction and injury of AT2s can result from and contribute to various lung diseases. Improved understanding of AT2 biology is, thus, critical for understanding lung biology and disease; however, primary human AT2s are generally difficult to isolate and limited in supply. To overcome these limitations, human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived type 2 alveolar epithelial cells (iAT2s) can be generated through a directed differentiation protocol that recapitulates in vivo lung development. iAT2s grow in feeder-free conditions, share a transcriptomic program with human adult primary AT2s, and execute key functions of AT2s such as production, packaging, and secretion of surfactant. This protocol details the methods for maintaining self-renewing iAT2s through serial passaging in three-dimensional (3D) culture or adapting iAT2s to air-liquid interface (ALI) culture. A single-cell suspension of iAT2s is generated before plating in 3D solubilized basement membrane matrix (hereafter referred to as &#34;matrix&#34;), where they self-assemble into monolayered epithelial spheres. iAT2s in 3D culture can be serially dissociated into single-cell suspensions to be passaged or plated in 2D ALI culture. In ALI culture, iAT2s form a polarized monolayer with the apical surface exposed to air, making this platform readily amenable to environmental exposures. Hence, this protocol generates an inexhaustible supply of iAT2s, producing upwards of 1 x 1030 cells per input cell over 15 passages while maintaining the AT2 program indicated by SFTPCtdTomato expression. The resulting cells represent a reproducible and relevant platform that can be applied to study genetic mutations, model environmental exposures, or screen drugs.

The present protocol describes human induced pluripotent stem cell-derived type 2 alveolar epithelial-like cells (iAT2s). These cells can be cultured as self-renewing spheres in 3D culture or adapted to air-liquid interface (ALI) culture.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 유형 2 폐포 상피 세포의 3D 구체 및 2D 공기-액체 계면 배양 생성

In the lung, the alveolar epithelium is a physical barrier from environmental stimuli and plays an essential role in homeostasis and disease. Type 2 ...

발생학

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

면역학 및 감염병학

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

생물학

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

의학

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled substances, including infectious agents and air pollutants. The airway epithelial layer plays a central role in a large variety of acute and chronic lung diseases, and various treatments targeting this epithelium are administered by inhalation. Understanding the role of epithelium in pathogenesis and how it can be targeted for therapy requires robust and representative models. In vitro epithelial culture models are increasingly being used and offer the advantage of performing experiments in a controlled environment, exposing the cells to different kinds of stimuli, toxicants, or infectious agents. The use of primary cells instead of immortalized or tumor cell lines has the advantage that these cells differentiate in culture to a pseudostratified polarized epithelial cell layer with a better representation of the epithelium compared to cell lines.
Presented here is a robust protocol, that has been optimized over the past decades, for the isolation and culture of airway epithelial cells from lung tissue. This procedure allows successful isolation, expansion, culture, and mucociliary differentiation of primary bronchial epithelial cells (PBECs) by culturing at the air-liquid interface (ALI) and includes a protocol for biobanking. Furthermore, the characterization of these cultures using cell-specific marker genes is described. These ALI-PBEC cultures can be used for a range of applications, including exposure to whole cigarette smoke or inflammatory mediators, and co-culture/infection with viruses or bacteria. 
The protocol provided in this manuscript, illustrating the procedure in a step-by-step manner, is expected to provide a basis and/or reference for those interested in implementing or adapting such culture systems in their laboratory.

Presented here is a reproducible, affordable, and robust method for the isolation and expansion of primary bronchial epithelial cells for long-term biobanking and the generation of differentiated epithelial cells by culture at the air-liquid interface.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

THP-1 세포에서 LPS/ATP 유발 세포 사멸 메커니즘 분석

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. LPS combined with ATP is a classic inflammatory induction method, often used to study pyroptosis, but apoptosis and necroptosis also respond to stimulation by LPS/ATP. Under normal circumstances, phosphatidylserine is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, the cell membrane remains intact and exposed to phosphatidylserine, and in the later stages, the cell membrane loses its integrity. Here, flow cytometry was used to analyze Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (AAD) double staining to detect the cell death from the whole cells. The results show&#160;that substantial cells died after stimulation with LPS/ATP. Using scanning electron microscopy, we observe the possible forms of cell death in individual cells. The results indicate that cells may undergo pyroptosis, apoptosis, or necroptosis after stimulation with LPS/ATP. This protocol focuses on observing the death of macrophages after stimulation with LPS/ATP. The results showed that cell death after LPS and ATP stimulation is not limited to pyroptosis and that apoptosis and necrotic apoptosis can also occur, helping researchers better understand cell death after LPS and ATP stimulation and choose a better experimental method.

저자 스포트라이트: LPS/ATP에 대한 THP-1 대식세포 반응 — Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis Spectrum 발표

This protocol is based on LPS and ATP-induced death of PMA-differentiated THP-1 macrophages. We use flow cytometry to analyze Annexin V and 7-AAD double staining to detect cell death, using the whole cell and employing scanning electron microscopy to observe the cell membrane morphology.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

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요약

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