이 프로토콜은 건강 및 질병에서 기도 상피 세포의 기능 및 역할과 관련된 다양한 연구 질문을 해결하는 데 사용할 수 있는 강력하고 비용 효율적인 방법을 위한 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 점액 생성 및 섬모 활동을 포함하여 인간 상피 세포층을 잘 나타내는 세포층을 생성한다는 것입니다. 이 기술은 다재다능하며 질병 관련 모욕이나 치료법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
시작하려면 10cm 페트리 접시에 10 밀리리터의 멸균 PBS로 인간 폐 조직에서 분리 된 기관지 고리를 헹굽니다. 핀셋으로 링을 잡은 상태에서 작은 가위를 사용하여 과도한 결합 조직과 혈액 잔여물을 제거합니다. 고리를 두 개로 자르고, 밀폐 된 멸균 용기에 Primocin을 함유 한 HBSS에 미리 데운 Protease 14 용액 10 밀리리터에 2 개의 반쪽을 담근다.
기관지 고리 조각을 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 조각을 10 밀리리터의 따뜻한 PBS가 들어있는 페트리 접시에 옮기고, 구부러진 핀셋을 사용하여 고리 내부를 긁어 세포 용액을 얻는다. 반지를 버리십시오.
세포 용액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 따뜻한 PBS를 첨가하여 50 밀리리터의 최종 부피를 얻는다. 세포 용액을 원심분리하고, 펠릿을 10 밀리리터의 따뜻한 PBS에 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인한다. PBS로 부피를 50 밀리리터로 만들고 원심 분리를 반복하십시오.
Primocin이 함유된 따뜻하고 완전한 KSFM에 펠릿을 다시 현탁합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트로부터의 코팅 용액을 웰 당 2 밀리리터의 세포 현탁액으로 교체한다. 세포가 80 내지 90% 밀도에 도달할 때까지 성장하도록 하고, PBECs의 동결보존을 위해, 웰로부터 배지를 흡인하고, 웰 당 2밀리리터의 따뜻한 PBS로 세포를 한번 세척한다.
웰 당 500 마이크로 리터의 부드러운 트립신을 첨가하여 세포를 트립신 화하고 섭씨 37도에서 5-10 분 동안 배양합니다. 트립신 용액을 소용돌이 치고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포를 방출합니다. 분리된 세포를 대두 트립신 억제제가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 KSFM 10밀리리터에 재현탁하기 전에 상청액을 버린다. 자동화 된 세포 계수기에서 세포를 세고 동결 배지에서 밀리리터 당 400, 000 세포의 농도로 세포를 다시 현탁시키고,이 현탁액 1 밀리리터를 극저온 혼합물에 첨가한다. 바이알을 차가운 세포 용기에 옮기고 섭씨 영하 80도에 놓습니다.
24시간 후 바이알을 섭씨 영하 196도의 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다. T75 세포 배양 플라스크를 코팅하기 위해, PBS에 10 밀리리터의 코팅 용액을 첨가하고, 플라스크를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 넣기 전에 뚜껑을 단단히 닫는다. 다음날, 플라스크의 코팅 용액을 10 밀리리터의 완전한 KSFM으로 교체하십시오.
인큐베이터에 공기가 들어오도록 뚜껑을 약간 연 상태에서 인큐베이터에서 배지를 섭씨 37도까지 데우십시오. 냉동보존된 PBEC를 섭씨 37도의 비드 수조에서 빠르게 해동합니다. 예열된 T75 플라스크에 극저온 내용물에 전체 내용물을 넣고 세포를 고르게 분배합니다.
세포가 단단히 부착되었는지 확인한 후 배지를 신선하고 따뜻한 완전한 KSFM 10ml로 교체하고 80-90% 밀도에 도달할 때까지 성장시킵니다. 삽입물당 400마이크로리터의 코팅 용액을 첨가하여 세포 배양 삽입물을 코팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 2밀리리터의 부드러운 트립신을 첨가하여 플라스크에서 PBEC를 트립신화하고 5-10분 동안 배양합니다.
플라스크를 소용돌이 치고 부드럽게 두드려 세포 분리를 촉진합니다. 다음으로, 4 밀리리터의 대두 트립신 억제제를 플라스크에 첨가하고, 세포 현탁액을 25 밀리리터 튜브로 옮긴다. 현탁액을 원심 분리하고 6 밀리리터의 완전한 BD 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
자동 세포 계수기에서 세포 수를 세십시오. 코팅 후 인서트에서 코팅 용액을 제거합니다. 1 나노몰 EC 23으로 보충 된 완전한 BD 배지로 세포 현탁액을 희석하고 삽입물의 멤브레인 상단에 500 마이크로 리터를 첨가한다.
1.5밀리리터의 완전한 BD 매체를 삽입물 아래의 웰에 추가합니다. 세포가 공기-액체 계면(ALI)으로 옮길 준비가 되면 삽입물과 웰에서 배지를 제거하고 50나노몰 EC 23이 보충된 새로운 완전한 BD 배지를 웰에만 추가합니다. 일주일에 세 번 우물의 배지를 교체하십시오.
과도한 점액과 세포 파편을 제거하려면 삽입물 내부 세포층의 정점 쪽에 따뜻한 PBS 200마이크로리터를 부드럽게 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 과잉 점액 및 세포 파편을 함유하는 PBS를 흡인한다. TEER은 ALI PBEC 배양의 품질을 평가하기 위해 측정되었습니다.
7 일 후, 300 옴보다 높은 세포층의 전기 저항은 성공적인 배양으로 간주됩니다. 또한, 공여체 간 전기 저항의 가변성은 공기-액체 계면에서 배양 7일째와 14일째 사이에 시간에 따라 감소하고, 사용된 DMEM의 기원에 의해 현저하게 영향을 받는다. ALI 배양 14일째 기저세포, 섬모세포, 잔세포, 곤봉세포와 같은 모든 주요 세포 유형을 관찰했으며, 발현 수준은 기증자에 따라 다름없었다.
시험된 EC 23의 상이한 농도 중에서, 최대 TEER는 50 나노몰에서 관찰되었다. 레티노산과 그 합성 유사체인 EC 23을 비교하면 섬모 세포와 배 세포에 대한 마커의 유전자 발현이 50나노몰 EC 23과 레티노산 사이에서 유사하다는 것이 확인되었습니다. 다른 공급자의 배지를 사용하면 세포 구성에 상당한 차이가 있는 반면 TEER의 차이는 덜 두드러졌습니다.
반면에, 상이한 공급 업체로부터의 삽입물을 사용하는 것은 세포 분해에 실질적인 차이를 초래하지 않았다. 또한, 완전한 BD 배지와 비교하여 ALI PBEC와 PneumaCult 배지의 TEER 값 및 세포 구성의 차이도 관찰되었습니다. 세포가 ALI로 옮길 준비가되면 EC 23 농도를 높입니다.
또한, 해동 후 세포를 원심분리하지 말고, SBTI를 첨가한 후 세포 배양 플라스틱으로부터 세포를 신속하게 제거한다. 이 프로토콜에 제공된 방식으로 기도 상피 세포의 배양을 사용하여 다양한 분석 방법을 사용하여 이를 추적하여 예를 들어 기도 상피 세포의 기능, 유전자 발현, 매개체 생산을 관찰할 수 있으며, 따라서 예를 들어 담배 연기에 대한 노출의 결과에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 세포 배양 프로토콜의 다음 단계는 면역 세포 또는 혈관 세포와 같은 추가 세포 유형의 통합이며, 이는 조직 표현을 증가시키는 데 도움이 될 것입니다.
