이 작품은 보조금 R01-CA169354에 의해 지원되었다 &#160; 및 R01-047822 &#160; 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 보훈 (ECB)에서 우수상에서. RKP는 NIH T32 CA009287-30A1, ASCO 젊은 연구자 상, 캘리포니아 유방암 연구 프로젝트 원정대, 그리고 미국 암 협회 (American Cancer Society) 가르 연구 학술 그랜트에 의해 지원되었다; BAZ는 NIH 보조금 AI079320에 의해 지원되었다. JM은 NIH T-32 훈련 보조금 T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 및 미국 암 학회 (American Cancer Society) 박사후 PF-12-052-01-CSM에서 연구비에 의해 지원되었다.

참고 : 모든 동물 실험은 승인 스탠포드, 팔로 알토 VA HCS, 보건 기관 AnimalCare 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 따라 실시 하였다. 1. 샘플 수집 및 처리를위한 준비 (소요 시간 : ~ 10 ~ 15 분) <ol><li> 이전 6 설명한 바와 같이 쥐 B16F0 흑색 종 세포 피하이나 여성 C57BL / 6 마우스의 복부의 중앙선 근처 (0.5 × 10 6) 접종. 대안 적으로, (예를 들면 측면, 유방 지방 패드 등)을 추가로 해부 부위에서 종양 세포를 접종. 주 : 종양의 임의의 수 (주입 또는 자발적인)이 프로토콜을 사용하여 평가할 수있다. 예를 들어, 다른 일반적 / 6 결장 선 MC38, 루이스 폐 암종 (LLC) 및 전립선 TRAMP-C2 선을 포함 C57BL 동계에서 종양을 사용 하였다. 면역 결핍 생쥐에 접종 인간 이종 이식편도 이러한 방식으로 평가 될 수 있지만, P는 것을 주목해야한다종양 침윤 백혈구 rofiles 반드시 호스트 마우스의 면역 결핍 상태에 따라서 변경 될 것이다. <ol><li> 전체 미디어 (예 : RPMI 10 % FBS 및 첨가제를 포함) 또는 다른 적절한 단백질 함유 버퍼 (예를 들어 HBSS 또는 PBS + 1 % FBS, 1 %의 BCS)를 사용합니다. 미디어를 진정 또는 이전 euthanization 4 ° C에 버퍼. </li></ol></li><li> 절제된 종양 수집 튜브 및 필터 설정; 얼음이 배치합니다. <ol><li> 종양 당 하나의 50 ML 원뿔 튜브를 사용하는 절제합니다. 각각의 40 ~ 70 μm의 세포 현탁액 필터를 삽입합니다. 또한, 금속 필터 메쉬 15 ML 원뿔 튜브를 사용합니다. 15ml의 튜브의 상단에 컵 형상의 필터를 생성하는 5 ㎖ 주사기 플런저 또는 두꺼운 펜을 사용한다. </li></ol></li><li> 절제 및 종양 처리를 위해 악기를 준비; 수술 집게와 절제하는 미세 가위 및 프로세스 종양을 사용합니다. 절제 / 종양 샘플 사이의 악기를 청소하는 70 % 에탄올을 사용합니다. 더 많은 수의 오의 경우샘플 F (예&gt; 10), 우리는 종양 샘플 사이의 처리 시간에서 상당한 차이를 방지하기 위해 여러 연구자들에 의해 표본의 동시 처리를 권장합니다. </li></ol> 2. 종양 절제술 (소요 시간 : ~ 5 분 / 종양) <ol><li> 개별적 이산화탄소 또는 기타 승인 된 방법을 사용하여 B16의 담암 마우스를 안락사. </li><li> 수술 단계에 마우스를 고정합니다. 70 % 에탄올로 종양 영역 스프레이 과잉 와이프 ​​오프; 이는 머리 존재의 확산을 방지하는 데 도움이됩니다. 필요에 따라 비 - 누드 마우스의 경우, 종래에 종양 절제 주위 피부 영역을 면도. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 상부를 포함하고 주변 피부, 일괄하여 피하 종양 절제. 촬영 &quot;여유&quot;피부의 양은 변화하지만, 전형적으로 피부 종양 약 2-3 mm로 절제 될 수있다. <ol><li> 이 시점에서 절제된 종양 (+/- 주변 피부) 무게. (PL) 내에 고정 필터에 절제 피부 / 종양 섹션을 배치ASTIC 원뿔 튜브. </li></ol></li></ol> 3. 단일 세포 종양 서스펜션을 준비 (소요 시간 : ~ 5-7 분 / 종양) <ol><li> 사용 집게와 가위 종양 위에 놓여 / 주변 피부를 말하다. 조직의 모든 큰 부분 1 ~ 2 밀리미터 섹션으로 처리 될 때까지 가위를 사용하여 샘​​플을 말하다. 참고 : 일반적으로, 전체 종양이 처리; 대안으로, 더 큰 종양, 종양의 대표 섹션 다진 및 처리 할 수​​있다. </li><li> 일회용 5 또는 10 ㎖ 주사기의 플런저를 사용하여, 기계적으로 보호 된 필터에 대해 다진 종양 조직을 해리하는. </li><li> 피펫을 사용하여, 감기 미디어 또는 버퍼의 5 ~ 10 MLS으로 처리 된 종양 조직을 씻는다. 이 필터를 통해 단일 ​​세포를 세척한다. </li><li> 총 수 및 세척의 볼륨이 대략 비슷한 크기의 종양에 대해 동일 보장, 위의 두 단계를 여러 번 반복합니다. <ol><li> 처리 된 종양 조직을 세척 한 후, 관찰피부 및 / 또는 기타 결합 조직의 작은 조각은 필터에 남아있을 것이다. </li><li> 대안 적으로, 콜라게나 제 및 / 또는 다른 효소 단독 기계적 세분화가 충분하지 않을 종양, 소화 종래 닦지 절차로 수행 될 수있다. 이것은 더욱 철저한 단일 세포 현탁액을 허용합니다. 그러나 소화 프로토콜 표면 항원 식 (20)에 영향을 미칠 수 있으므로주의가 이러한 결과를 해석 수행되어야한다는 것을 알 수있다. </li></ol></li><li> 씻고 버퍼 / 미디어를 추가하고 5 분 동안 4 ° C 500 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li></ol> 단일 세포 현탁액의 4 FACS 염색 (소요 시간 : ~ 30 ~ 60 분) <ol><li> 차가운 얼음 FACS 버퍼에 재현 탁 세포 (PBS + 1 % FBS). </li><li> 트리 판 블루와 hemacytometer, 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 볼륨 당 총 생균 수율을 결정합니다. 이 데이터를 외삽하는데 사용될 수있다FACS 데이타와 함께 종양 침윤 백혈구의 절대적 숫자. </li><li> 결정 세포 수와 염색은 FACS로 분석한다. 이것은 여러 가지 요인 (예 : 종양 조직 학적 유형, 연령, 종양 크기, 백혈구 침윤의 평균 백분율 등)에 의해 영향을받을 것이다. 주 : B16 흑색 종에서는 종양 침윤 백혈구 백분율 낮은 실측치 (TIL을 전형적으로 &lt;5 %) 종양 세포에 비해. 따라서, 적어도 1 × 106 총 종양 (종양 침윤 백혈구 +) 세포는 일반적으로 분석을 위해 FACS를 통해 수집 하였다. <ol><li> 트리 판 - 얼룩진 계수 데이터를 이용하여, 계산 된 셀의 체적에 대한 FACS 염색한다. TIL은 일반적으로 전체 종양 세포의 5 %를 구성하는 경우, 예를 들어 (종양 세포의 많은 트리 판 얼룩 죽은 것), 단일 종양 세포 현탁액의 총 개수의 요인이 염색한다. </li><li> 흔하지 백혈구 아형의 경우) + CCR9 예 : PDC (총 종양 세포를 더 많이 사용예 2-3에서는 단일 세포 현탁액 중의 이들 세포의 상대적인 저주파 주어진 FACS 염색 용) 10 X 6. </li></ol></li><li> FACS 용 단일 종양 세포 현탁액 얼룩. <ol><li> 라이브 / 죽은 차별를 들어, 고칠 얼룩 또는 비 고칠 얼룩 (예 : 프로피 디움 아이오다 이드) 사용할 수를 사용합니다. 셀 라이브 / 죽은 차별없이 염색하는 경우,주의 항체의 비 특이 적 결합의 가능성을 부여 통보해야합니다. </li><li> 표준 FACS 염색 프로토콜을 사용하여 특정 서브 세트에 대한 백혈구 세포 현탁액 얼룩. 블록 세포는 PBS / 1 % FBS 쥐 혈청의 Fc 블록 항원 - 특이 적 항체로 염색하기 전에 10 분 동안 (항 CD16 / 32)를 함유하여 비특이적 결합 된 항체를 감소시킨다. 염색 특정 확인하기 위해 올바른 이소 제어 항체를 포함합니다. </li><li> FACS 염색이 완료된 후이 시점에서, 4 % 포름 알데히드 또는 다른 유사한 고정 제와 함께 샘플을 고정한다. 다 4 ° C에서 보관 샘플RK 수집 및 분석의 시간이 될 때까지 (형광의 담금질을 피하기 위해). 주 : 오랜 시간 동안 고정 된 샘플을 저장하는 것은 형광 물질 (21)의 신호 강도의 변화가 발생할 수 있습니다. </li><li> 유량 계측기의 샘플을 수집합니다. 설정 사이토 최적의 흐름은 장비 및 레이저 / 검출기 설치 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 참고 : 또한, 심지어 같은 기계를 사용하는 경우 실험 사이에 변화가있을 수 있습니다. 따라서, FACS 수집 및 각 실험의 분석에 앞서 적절한 보정 설정을 보장하기 위해 (예 : 교정 구슬을 사용하여) 해당 기계 설치를 수행합니다. </li></ol></li><li> leukoctye 부분 집합의 분석 <ol><li> , FACS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 라이브 / 죽은 얼룩의 경우, 죽은 세포를 게이팅에 의해 시작합니다. 살아있는 세포 내에서 백혈구를 식별하기 위해 백혈구 특정 마커 (예를 들면 항 CD45)에 대한 항체를 사용합니다. <ol><li> 이 후, 다양한 GATI를 사용NG 방식은 염색 프로토콜에 따라, 특정 서브 세트를 식별한다. 예를 들어, CD4 + T 세포를 식별 CD45 + 집단에서 SSC LO 영역을 선택하고 CD19-CD3 + 세포를 선택하는 단계; 이 CD4 + T 세포로부터 (22)를 식별 할 수있다. </li></ol></li><li> (즉, 서브 세트를 정량화 총 숫자, 백분율 또는 비율을 사용하는) 데이터를 분석하고 일관성을 보장 및 패턴 또는 트랜드를 식별하기 위해 다수의 다른 방법을 제시한다. 참고 : 예를 들어, 우리는 수집 된 총 종양 세포 (도 1)의 비율로 총 살아있는 CD45 + 세포 보았다. 또한, 우리는 백혈구 종양 내의 각 서브 세트 (예를 들어, CD4 + T 세포)의 백분율을 계산하고, 제어 및 시험 그룹 (도 3) 사이의 비율을 비교하여 이들. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

종양 미세 환경의 상세한 분석을 수행하는 메커니즘과 면역의 효과를 결정하는데 중요하다. 종양 침투 백혈구에 이러한 에이전트의 영향을 이해하는 인간의 임상 영역에서 immunotherapeutics의 증가 존재와 그들의 작용 메커니즘을 정의하는 필수가되고있다. 인간에서 종종 이와 주연 면역 반응의 분석을 획득하고 백혈구 서브셋 분석 종양 조직을 분석 및 임상 및 / 또는 로지스틱 어려움이 존재는 종...

종양의 성장 및 홍보 및 회귀 사이의 균형은, 부분적으로 미세 1, 2에 존재하는 프로와 항 종양 침투 백혈구의 균형에 따라 달라집니다. (TME)를 종양 미세 환경을 연구 구체적 침투성 백혈구 아 집단을 식별하기 위해, 우리는 쥐 종양 모델에서 피하 종양의 평가 방법을 개발 하였다. 종양 미세 환경 연구의 중요성은 잘 알려져 있으며, 문헌에지지된다. 많은 연구 프로 및 항 종양 면역 세포 침윤의 밸런스가 마우스에서뿐만 아니라, (3,4-에서 검토) 인간 결합 연구뿐만 아니라, 종양 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, Curiel 등은. 난소 암 환자의 임상 결과는 종양 침윤 규제 CD4 + T 세포 (Tregs) (5)의 비율을 증가의 존재와 상관 관계가 있었다 악화 것으로 나타났다. 우리 자신의 작품 또한 아무런 효과를 보여 주었다또한, 상관 관계를 마우스 흑색 종 모델 6에 백혈구 아형의 비율 VEL 백혈구 화학 유인 물질은 종양 성장을 감소시켰다. 따라서, 종양 내의 백혈구의 서브 세트 상세한 분석은 더욱 광범위하게 인식되고 점차 중요. 백혈구 침투에 대한 종양 미세 환경을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다; 능력에 일부 - 예를 들어 그룹은 이미지 TME 7, 고전 면역 조직 화학 및 MRI, PET, 공 초점 현미경 9-11 등 다양한 이미징을 포함하여 보존 섹션 8의 면역을 위해 다양한 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 설계했다 intravitally (10, 12) 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 나노 입자 (13)이나 신규 한 조영제 면역 세포에 라벨 (14) 등의 각종 분자 조영제로 사용될 수있다. 우리의 방법은 유동 세포 계측법 기반 접근법이며, 몇 가지 장점을 갖는다.우선, 전체 종양 미세 환경이 샘플링 될 수있다; 분석시에, 전체 주변 피하 종양 주변부 절제 수술로 처리된다. 이는 단일 종양 내의 잠재적 샘플링 바이어스를 제거하고, 전체적으로 더 많은 종양 &quot;글로벌&quot;분석을 제공한다. 둘째, 백혈구 서브 세트를 분석하는 다색 유동 세포 계측법을 사용하여보다 구체적으로 침윤하는 백혈구의 표현형을 측정 할 수있게 해준다. 사용 된 색의 개수에 따라, 매우 특정한 서브 세트가 식별 될 수있다. 심지어 일반적인 서브 타입 분류 - - 종양의 운명을 결정하는데 잠재적으로 중요한 의미를 다른 기능을 갖는 여러 특정 백혈구 세포 유형 내에서 서브 세트가 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 형질 수지상 세포 (PDC)은 항 종양 면역 (15)에 연루되어있다. 그러나, PDCS의 CCR9 + 서브 세트 tolerogenic 16로 도시 한 BA를 이동 한이러한 서브 세트의 랜스는 종양 성장에 영향을 미칠 수있다. 우리의 방법은 피하 또는 일괄하여 절제 할 수있는 다른 종양에 적절하고 있습니다. 우리의 손에, 종양 균일 안락사시 절제 하였다. 일부 연구에서 수행 된 바와 그러나 피하 종양이 완전히 따라서 동물의 추가 평가를 허용 생존 수술 (17)에서 주변의 피부 절제하여 고정 될 수 있음을, 생각할 수있다. 분석 후, 절제된 종양에 대해 수행된다. 따라서, 상기 결과는 종양의 발달에 단일 평가시기를 나타낸다. 이 미세 환경에 대한 자세한 모습을 수 있지만, 그것은 또한 의심의 여지 역동적 인 과정이 무엇인지의 정적 사진입니다. 그러나, 절연 백혈구 (예를 통해 자기 분리 또는 밀도 구배) previ 한 이래로 후, 종양 상피 및 간질 별도로 분석, 또는 상기 표현형을 정의하는 다른 기능 분석에 사용될 수있다ously 18을 설명했다. 이 방법은, 그 후, 자연 투병 기간의 설정에서, 또는 특정한 치료 학적 섭동 후인지, 소정의 시점에서 종양 미세 환경 내의 백혈구의 조성을 이해에 관심이있는 연구자에 유용 할 것이다. 우리가 수행되어 있지 않지만,이 절차의 변형, 잠재적으로 격리에서 종양의 특정 부분을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 종양의 크기가 주어진 주변부 구역 (들)은 연구자에게 종양 미세 환경의 공간적 분리 더 파악할 수 있도록 거리의 중앙 종양, 괴사 가능성 코어 해부 될 수있다. 종양 면역학의 급성장 필드에 의심의 여지가 생쥐 종양 모델에서 새로운 면역 조절제를 평가하는 연구의 기하 급수적으로 증가 수 없을 것이다. 몇몇 보고서 주연 EN 대 종양 내의 특정 백혈구 기능의 차이를 강조vironment. 예를 들어, 쉐이퍼 - 버 외는.들은 종양 미세 환경 (19)에 트래픽이 일단 항원 - 특이 T의 효과기 CD8 + 세포는, 주변부에서 활성 상태, CD8 + T 억제 세포로 형질 전환 된 마우스 모델에서 나타났다. 이 TGFβ에 의한 부분이었다, 그러나 다른 요인은 가능성뿐만 아니라 참여하고 있습니다. 따라서, 백혈구 아형 평가 - 숫자 및 비율뿐만 아니라 기능적 상태 - 종양 자체 내 것은 종양 운명에 특정 면역의 효과에 대한보다 정확한 표현을 제공한다. 우리의 방법은 종양의 상세한 분석이 가능하고 연구원 더욱 가깝게 접근 이전보다 백혈구 개체수의 변화를 식별 할 수있는 기회를 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

종양 미세 환경에 침투 특수 면역 세포는 종양의 성장 및 생존을 조절한다. 악성 세포는 회피 또는 생존하고 번영하기 위해 항 종양 면역 반응을 파괴해야합니다. 종양 tolerogenic DC 모집, 면역 조절 T 세포 (Tregs), 및 세포 독성 항암 반응을 억제하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 면역 상이한 메커니즘 번호 &quot;탈출&quot;활용. 종양 억제에 참여할 수있는 모든 면역 자극 수지상 세포, 선천성 항 종양 면역 항구 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 : 반대로, 항암 효과기 면역 세포는 악성 종양 성장 및 팽창을 늦출 수있다. 프로와 항 종양 백혈구 사이의 균형은 궁극적으로 행동과 형질 전환 된 세포의 운명을 결정한다 인간의 임상 연구의 군중이를 부담했다. 백혈구 하위 집합 따라서, 상세한 분석 내종양 미세 환경은 점점 더 중요 해지고있다. 여기서 우리는 마우스 종양 모델에서 종양 미세 환경에 존재하는 백혈구 침투하는 서브 세트를 분석하기위한 방법을 설명한다. B16 마우스 흑색 종 종양 세포는 C57BL / 6 마​​우스에서 피하 접종 하였다. 지정된 시간에, 종양 주위의 피부는 일괄하여 절제 한 후 유동 세포 계측법 멀티 색상 염색 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 백혈구 집합 마커의 다양한 사용하여, 우리는 제어 및 chemerin 발현 종양 사이의 백혈구 하위 집합을 침투의 상대적 비율을 비교할 수 있었다. 연구자들은 면역 종양 미세 환경에 존재하고 종양 성장의 전통적인 캘리퍼 크기 측정과 결합 될 때, 잠재적으로 그것들이 종양 성장에 면역 조성의 변화에​​ 미치는 영향을 규명 할 수 공부 이러한 도구를 사용할 수있다. 이러한 기술은 모든 종양 모델에 적용 할 수있는 종양 미세 환경과의 C이 절제되고 처리 될 수있다.

우리의 결과는 과발현 쥐 B16 종양에 chemerin의 강제 종양 침투 백혈구 (TILS)의 비율을 증가 것으로 나타났다. 또한 chemerin 발현과 연관된 종양 미세 환경 내에서 표시되는 백혈구 아형의 상대적인 비율의 변화가 확인되었다. Pachynski 등. (6) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다. 도 1은 17 일 절제된 종양의 FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 대조군과 비?...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K 조회수.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

비디오: Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

전립선 발암 및 양성 전립선 비대증의 평가를위한 신장 캡슐 Xenografting 및 피하 펠렛 주입

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...