이러한 프로토콜은 면역 조절제 공격의 항종양 활성을 연구하는 효과적인 방법을 제공합니다. 더욱이, 순환하는 사이토카인 및 면역 세포 집단에서 관련 기회의 분석은 이러한 제안된 방법을 사용하여 수행될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 종양을 이식하고 성장을 모니터링하는 쉽고 간단한 방법이라는 것입니다. 이 기술의 직접적인 의미는 항암 연구에서 특정 치료법이나 도전 과제의 효능을 평가하는 것입니다. 또한 이러한 기술의 일부 측면은 독성 연구에 적합합니다. 시작하려면 섭씨 37도에서 예열된 수조에서 쥐 EERL 세포의 냉동 바이알을 해동하고 따뜻한 배양 배지가 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 섭씨 25도에서 5분 동안 G의 277배로 원심분리하여 미디어를 제거합니다. 그런 다음 세포 구개를 3-5 밀리리터의 신선한 배지에 다시 현탁시키고 T25 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터와 5%의 이산화탄소에서 세포를 성장시키고 더 큰 플라스크로 확장하고 3일마다 통과시킵니다. 원하는 모든 마우스에 이식하기에 충분한 세포가 있으면 플라스크를 제거하고 배지를 버리고 PBS 세포를 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 0.25% 트립신 EDTA 4밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. 트립신 반응을 멈추기 위해 새 배지를 추가하고 50밀리리터 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 세포를 새 배지에 다시 현탁시키고 세포를 계산합니다. 한 번 더 원심분리한 다음 셀에 저온 PBS를 추가하여 밀리리터당 1,000만 셀의 최종 농도를 만듭니다. 주입하기 전에 세포 현탁액을 얼음 위에 두십시오. 에탄올 패드로 옆구리를 소독합니다. 생쥐에 세포 현탁액을 주입하려면 100마이크로리터의 세포 현탁액을 주사기에 흡인하고 상단에서 모든 기포와 데드 스페이스를 제거합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 마취된 마우스에 느리고 꾸준한 방식으로 피하 주사합니다. 동물들을 각각의 우리에 넣고 마취에서 회복될 때까지 관찰합니다. 혈액을 모으려면 주로 사용하지 않는 손으로 어깨 너머로 느슨한 피부를 잡고 18게이지 바늘이나 채혈침으로 턱밑 정맥을 찔러줍니다. 200-300 마이크로리터의 혈액을 1.5 밀리리터의 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브 또는 혈청 분리기 튜브에 모읍니다. 채혈 후 출혈이 멈출 때까지 천자 부위에 부드러운 압력을 가합니다. 쥐를 각각의 케이지로 돌려보내고 마취에서 회복될 때까지 관찰합니다. 채취한 혈액을 실온에서 20-30분 동안 응고시킵니다. 그런 다음 원심분리할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 응고된 혈액을 섭씨 4도에서 15분 동안 1, 540배 G로 원심분리하고 위에서부터 조심스럽게 혈청층을 채취합니다. 혈청 또는 혈장 샘플을 얼음 위에 보관하면서 해동합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 540배 G에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 침전시키고 상단에서 혈청 층을 조심스럽게 수집합니다. 멀티플렉스 키트를 실온에 놓고 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행합니다. 각 마우스를 등을 대고 눕히고 복부 피부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 겸자와 가위를 사용하여 쥐의 오른쪽에서 림프절을 자르고 왼쪽에서 종양을 잘라냅니다. 종양이 크면 작은 조각으로 자르고 조직에서 약 500-600mg을 떼어냅니다. 3-5 밀리리터의 RPMI 배지가 들어 있는 각각의 해리기 튜브에 조직을 놓습니다. 자동 해리기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 균질화 후 70마이크로미터 필터를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 원추형 튜브로 여과합니다. 섭씨 25도에서 5분 동안 G의 277배로 원심분리하여 배지를 제거합니다. 1-2 밀리리터의 차가운 PBS에서 세포를 세척하고 다시 부유시킵니다. 0.4% 트립신 블루 염색을 사용하여 혈구측정기에서 생존 가능한 세포를 계산합니다.2-300만 개의 셀을 얻는 데 필요한 부피를 계산하여 해당 팩스 튜브로 전송합니다. 원심 분리기는 섭씨 25도에서 5 분 동안 277 배 G에서 세포를 계산했습니다.상층액을 디캔팅하고 세포를 300 마이크로 리터의 PBS로 다시 현탁시킵니다. 튜브당 0.5-1마이크로리터의 좀비 염료를 넣고 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 셀을 원심분리: 1-2밀리리터의 팩스 버퍼로 셀을 세척하고 200마이크로리터의 팩스 버퍼에 다시 매달아 놓습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 FC 수용체 차단제를 추가하고 10분 동안 세포를 배양합니다. 앞에서 설명한 설정으로 다시 원심분리하고 1-2밀리리터의 팩스 버퍼로 셀을 세척합니다. 항체 칵테일을 넣고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 원심분리하고 1-2밀리리터 팩스 버퍼로 세포를 세척합니다. 300-400 마이크로 리터의 2 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하고 고정을 위해 다시 현탁시킵니다. 세포를 섭씨 4도에서 며칠 동안 보관하거나 다색 유세포 분석기로 즉시 분석합니다. 본 연구에서는 폴리안하이드라이드 IL-1의 항종양 활성을 살펴보았다
