R01AA016837 (JCB)와 P20AA017828 (AGD와 JCB) :이 연구는 국립 보건원, 국립 알코올 중독과 알코올 남용 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.

분석하기 전에 날에 대해 수행 할 1 단계 <ol><li> 신선한 선충 성장 매체에 L4 무대 웜을 선택 (NGM) 판 OP50 E.의 잔디 파종 20 주 / N에서 대장균, 문화를. 각각의 분석 조건 (10) 웜이 필요합니다; 웜의 O / N 손실을 허용하는 웜의 과잉을 선택합니다. <ol><li> 첫날 성인들만 분석 동물; 많은 돌연변이가 야생형보다 느린 속도로 성장한다. 테스트 한 모든 동물이 처음 일 성인 있도록 발달 지연이 균주에 대한 따기의 타이밍을 조정합니다. </li></ol></li></ol> 2 단계 분석의 날에 수행하는 <ol><li> 분석을위한 준비 : <ol><li> 표준 시드 화 60 X 15mm NGM 판에 분석을 수행합니다. 판 모두 뚜껑 오프로, 2 시간 동안 37 ℃에서 사용하는 건조. 각각의 실험 시험의 경우, 네 건조 NGM 판을 사용한다; 이들은 0 mM의 400 mM의 에탄올 분석 플레이트 및 동반 적응 판을 것입니다. 참고 :NGM 플레이트의 사용은 여기에 중요하다 판의 조성의 차이가, 특히 그들의 삼투압에 강하게 행동에 에탄올 용량 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 동물 (20)에 의해 축적 된 에탄올의 양의 변화에 적어도 부분적으로 기인한다. NGM 한천 160 mOsm입니다. </li><li> 건조 후에, 시드 화 NGM 판 각각이 분석에서 사용 중량을 유의하여야 무게. 빈 접시의 중량을 기준으로 번호판 미디어의 볼륨을 결정한다. 볼륨 한천의 중량의 변환을 근사, 미디어가 같은 부피의 물과 동일한 무게가 있다고 가정한다. 주 : 당점 일관된 결과가 원래의 10 ml의 용적이 8.3-8.9 ml이다 건조 후의 부피가 충분히 탈수했다 NGM 매체와 함께 밝혀졌다. 2 시간 건조 시간에 대한 대안은 플레이트 044의 차이를 설명하기 위해이 범위의 부피에 도달 할 때까지 건조한다. </li><li> 4 구리 반지 (1 내경 용융.6cm) 판의 표면은 약 3 염에 다른 유전자형 또는 worms.Grasp 각각의 집게 링, 열 치료 그룹에 대한 가축 우리 (분젠 버너에서 강한 불꽃이 잘 작동)로 작동으로 초. 여전히 &#39;건너 뛰기&#39;에서 그것을 방지하기 위해 집게로 반지를 잡고 즉시 접시에 반지를 배치합니다. <ol><li> 링 반지의 여러 지점에서 집게로 가볍게 아래로 눌러 한천의 표면에 평평하게 달려 있는지 확인합니다. 반지를 배치 할 때, 추가로 3 반지를위한 공간을 확보하기 위해주의해야합니다. </li><li> 네 개의 모든 카메라의 시야가 맞춰 지도록 함께 가깝게 가능한 올려 놓으주의하면서 판의 표면에 구리 세 개의 추가 고리를 녹아. 참고 : 한천과 좋은 도장을 만드는 것은 분석하는 동안 링에 벌레를 유지하는 것이 필수적입니다. 접시에 건너 뛸 반지는 한천과 올바른 도장을 할 가능성이 있으며벌레가 파고 할 수 있으며 벌레를 시각화 방해 한천을, 흉터 수 있습니다. </li><li> 각 분석 판 건조한 시드되고 더 에탄올을받을 수 없습니다해야 첨부 &quot;적응&quot;판을 준비합니다. 이 판에 네 개의 구리 반지를 놓습니다. </li></ol></li><li> 링 자체의 시야 쓰지주의하면서 옆 링에 사용되는 웜 균주 각각 링 플레이트 하단 레이블. 그 동반 순응 플레이트 분석 플레이트에 레이블을 맞 춥니 다. </li><li> 최종 농도가 0 mm로부터 400 mM의 에탄올 (부피 중량)가되도록 각각의 분석 플레이트에 추가 100 % 에탄올의 양을 계산한다. 각각의 실험을 위해 (N = 1), 하나의 0 mM 내지 400 mM의 하나의 에탄올 플레이트있을 것; 순응 판은 에탄올을받지 않습니다. 판의 표면 주위를 피펫 팅, 에탄올을 추가합니다. 플레이트를 밀봉하기 위해 실험실 막을 사용하고 2 시간 동안 벤치 탑에서 평형을 허용한다. </li><li> 1.5 시간이 경과하면, 상기 분석 단계 2.2 순응하는 단계를 시작한다. </li></ol></li><li> 운동 분석을 수행 분석 판을 <ol><li> 조심스럽게 순응 접시에 구리 반지의 중심에 각 실험군의 10 웜을 전송합니다. 웜 픽으로 조심스럽게 긁어서이 시점에서 한천에서 볼 수있는 모든 음식을 제거합니다. 동일한 시험 균주에서 동일한 순서로 플레이트 상에 배치되지 않도록 실험군은 실험에 걸쳐 시험 플레이트 상에 배치되는 순서를 다양하다. 주 : 목표 순응 접시에 식품 분석 플레이트에 전달되면 벌레 음식과 운동에 약물의 효과 가려한다 주위 응집되므로, 식품의 최소량으로 플레이트에 동물을 전송하는 것이다. </li><li> 이 벌레가 굴을 할 수 있도록하고, 분석을 방해하므로, 선택과 한천의 표면을 파괴하지 않도록주의하십시오. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 웜. </li><li> 각 판의 입문 사이에 적절한 간격이 있는지 확인하십시오. 숙련 된 실험자 (40) 동물, 4 반지 &lt;1.5 분 동안 10 / 반지를 이동할 수 있지만, 2 분까지의 간격은 허용됩니다. 표준 분석은 10 ~ 12 분 0 mM의 400 mM의 에탄올 모두 노출의 30 ~ 32 분에서 기록 영화가 있습니다. </li><li> 0 mM의 노출에 대한 순응 판과 약 2 분 30 초 떨어져 두 번째 영화가 시작해야합니다 전에 첫 번째 동영상 파일의 저장이 가능하도록 400 mM의 노출에 대한 적응 판을 시작합니다. </li><li> 30 분의 적응 기간 후, 분석 플레이트에 순응 판에서 벌레를 전송합니다. 그들은 각 플레이트의 사이 완료 타이밍을 추적, 순응 플레이트에 첨가하는 것과 동일한 순서로 분석 플레이트에 웜 (0 MM 또는 400 mM의 에탄올)를 전송합니다. 에탄올을 증발 손실을 최소화하기 위해 실험실 필름 : 봉쇄 판. </li><li> 유평평해진 선택의 상단에 벌레를 수집하는 얇은 가장자리가 평평 웜 골라 함께 떠 운동을 SE는. 이 선택에 벌레를 붙 도움으로 일반적으로 웜을 전송에 사용되는 박테리아를 사용하지 않고 분석 플레이트에 시드 화 순응 플레이트 웜의 전송을 수행합니다. 주 : 접시에 제 웜이 플레이트에 첨가 마지막 웜 이상 에탄올에 노출되기 때문에, 동물이 단계에서 전달되는 속도가 매우 중요하고, 이전 시점이 약간의 시간 의존적 효과를 보여줄 수있다. 이 균주는 실험 반복 실험을 통해 처음으로 접시에 배치되는 회전의 주요 이유입니다. </li></ol></li><li> 로코 분석을 수행 얇은 껍질을 <ol><li> 등으로 2048x2048 7.4와 0.5 배 현미경 목적, 0.8 배의 배율 카메라로 시야 (약 42x42 mm 2 광장)에서 네 개의 링을 동시에 이미징 할 수있는 현미경 / 카메라 조합을 사용하여81; m 화소 CCD. </li><li> 강도 임계치 단계에서 물체 인식 에이즈 시야에 걸쳐 심지어 조명을 사용하여 (아래 참조). 3 &quot;X3&quot;백라이트가 잘 작동합니다. </li><li> 이미지 광원 전송되는 기존의 현미경에 비해 백라이트를 사용하는 경우 손실 대비를 생성하는 판에 배치 미디어 측 최대의 벌레 (덮개 아래). </li><li> 이동 벌레의 시간 경과 영화를 캡처 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 2 분 (120 프레임)의 동영상으로, 12 비트 그레이 스케일 이미지 1 초를 캡처 할 수있는 소프트웨어를 설정합니다. 여전히 충분한 이미지 해상도를 유지하면서, 출력 파일의 크기를 줄이기 위해, 1024 × 1024 화소의 이미지를 캡처하는 2 × 2 비닝 모드를 사용한다. </li><li> 동영상을 기록합니다. 마지막 웜 후 10 분은 그 판에 배치 된 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)의 120 프레임 동영상 촬영을 시작합니다. 동영상 파일을 저장합니다. </li><li> 제 2 플레이트 (400 mM의 에탄올)을 기록한다. 이 과정을 반복마지막 웜 후 30 분부터 두 플레이트는 각각 노광용 30-32 분 시점을 캡처하는 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)에 배치했다. 참고 : 분석 할 다음 판으로 녹음을 시작하기 전에 각 캡처 세션 후 이미지 파일을 저장하기에 충분한 시간을 준다. </li><li> 보관 된 영화의 미래 교정 및 8 비트 256 그레이 스케일 TIFF 파일에 각 영화의 사본을 변환,이 영화가 개방 및 ImageJ에 (28)와 같은 다른 공개 오픈 소스 이미징 소프트웨어 프로그램에 의해 분석 될 수 있도록. 주 : 여기에서 설명 된 이미지 분석 소프트웨어 독자적인 파일 포맷을 사용한다. </li></ol></li><li> ImagePro 소프트웨어를 사용하여 영화의 분석. <ol><li> 촬영 후에는 이미지-Pro 소프트웨어 또는 그와 동등한 Plus를 사용하여 영화를 분석 할 수 있습니다. 주의 : 다른 물체 추적 소프트웨어의 다양한 여러 성공적 C.을 추적하는 데 사용 된 것을 사용할 한 번에 29 등의 엘레소프트웨어는 합리적 오브젝트의 식별 단계가 유사한 원리에 기초하여 여기서 설명 된 바와 해당 대체 할 수있다. 설명하는 방법은 약간의 차이가있을 수 있습니다 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어 버전 6.0-6.3 및 7.0, 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어의 새 버전에 관한 것이다. </li><li> 2 분 (120 프레임) 세그먼트에서 영화를 분석 할 수 있습니다. 먼저, 배경 평탄화 및 웜 물체의 콘트라스트를 향상시키기 위해 화상에 필터를 적용한다. 다음과 같이 필터를 선택 : 메뉴&gt; 프로세스&gt; 필터&gt; 향상&gt;는 평평 : 매개 변수 : 배경 = 다크; 폭 = 20 픽스 기능이 있습니다. </li><li> 필터링 단계 후 영화를 다시 저장하지만 항상 필터링되지 않은 형태로 원본 동영상을 유지합니다. <ol><li> 배치 및 구리 반지와 중복 할 수있는 크기이자 (ROI)의 원형 영역과 별도로 각 링에 동물의 운동을 분석한다. 확인하고 메뉴&gt; 측정과 벌레를 추적&gt; 트랙 ... 명령 개체; 이 추적 D를 불러옵니다ATA는 표 창. 추적 옵션 버튼은 특정 트랙을 제외하고 모든 실험 유물을 제한 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 자동 추적 탭에서 다음 매개 변수를 사용 : 트랙 매개 변수 : 속도 제한 (검색 반경) = 400 μm의 / 프레임, 가속 한계 = 자동, 최소 총 트랙 길이 = 400 μm의, 우위 모션 유형 = 혼란; 트랙 매개 변수의 객체는 : 부분 트랙 = 예, 최소 길이 = 21 프레임, 추적 예측 깊이 = 1 프레임을 허용합니다. </li><li> 추적 프로세스를 시작하려면, 자동으로 모든 트랙을 찾아 개수 / 크기 옵션 대화 상자와 추적 대화 상자를 표시하는 버튼을 기능을 클릭합니다. 분석 용 웜 오브젝트를 강조하고 밝은 배경 픽셀을 무시하도록 웜 화소의 계조 강도를 사용하는 중요한 임계 공정을 제공 개수 / 크기 대화 상자의 강도 범위 선택을위한 수동 옵션을 선택한다. <ol><li> 강도 임계 값을 조정 SLI폰더 모든 어두운 오브젝트를 강조 포괄적 범위를 만들기 위해 (하나의 하한을 설정하기 위해, 하나의 상한을 설정하기 위해). 0-4,095의 규모에 0-1,500의 범위는 미세한 튜닝을위한 좋은 출발점이 될 것입니다. </li><li> 이러한 구리 링과 접시에 이물질 같은 단일 웜 개체보다 크고 작은 개체를 제외 할 크기의 필터를 적용합니다. 측정과 자세의 다양한 개별 웜에 대한 크기를 덮이 작업을 수행하는 두 개의 크기 매개 변수를 설정&gt; 카운트 / 크기 옵션 대화 상자에서 선택 측정 메뉴 항목을 선택합니다. (지역 범위 : 28,000-120,000 μm의 2 및 경계 범위 : 600-2,500 μm의). </li><li> 변이주가 분석 될 접시에 상당히 작거나 다른 동물보다 크면 설정을 변경할 필요가 없도록, 제 동물을 추적하기 전에 균주의 다른 크기를 수용하기 위해 객체 인식 용 필터 설정의 범위를 확장 중간 분석. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 추적 대화 상자에서 계속을 클릭하여 추적 프로세스를 완료합니다. 시각적으로 자동 필터 설정에 따라이를 제외 할 타당한 이유가없는 한 모든 웜이 표시되어 있는지 확인하기 위해 영화의 각 웜의 진행과 출력 트랙을 비교합니다. 수동 필터 크기 기준을 만족 확인 비 웜 물체의 존재에 의해 생성 된 트랙을 삭제. </li><li> 각 프레임 사이의 각각의 웜의 속도를 계산하는 소프트웨어를 사용하여 (거리는 프레임 간의 1 초당 물체의 무게 중심에 대해 이동) 및 웜의 인구 모든 트랙에 걸쳐 각 트랙에 대한 평균 속도와 평균 속도를 표시 구리 반지. 마지막 평균이 실험 시험의 관점에서 N = 1로 고려한다. 통계 분석 및 데이터 보관을위한 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 보냅니다. </li><li> 데이터가 플레이트에 제 1 링에 대해 기록 된 후, 그 다음에 링 ROI를 놓고매개 변수를 변경하지 않고도, 추적 처리를 반복한다. </li><li> 운동을 통해의 상대 속도를 계산 : </li><li> 상대 속도 (%) = 처리 치료 (400 mM의) 속도 / (0 mM의) 속도 × 100. 참고 : 다른 유전 적 조작은 종종 동물의 기저 운동 속도를 변경. 동물의 운동 속도에 대한 에탄올의 효과를 결정하는 다른 유전자형 또는 증상에 걸쳐 이러한 효과를 비교할 수 있도록하기 위해, 상대 속도를 계산한다. </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+assess+initial+sensitivity+and+acute+functional+tolerance+to+hypnotic+effects+of+ethanol.">A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

C.에서 사용할 수있는 간단한 신경 생물학 및 유전 적 도구 엘레 웜 행동에 에탄올의 효과의 분자 기초를 공부하는 우수한 모델합니다. 여기서는 8,10,20,24,25을 에탄올 급성 행동 반응의 여러 환경 매개체 분자를 식별하는 데 사용 된 분석법을 설명한다. 이 방법은 함께 포유 동물에서 응답의 수준의 복합 표현형 모델, 분화 및 두 개의 서로 다른 에탄올 응답 행동 표현형, 초기 ...

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by na&#239;ve drinkers3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components6. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.
The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals10-16, and have been implicated in abuse liability in humans17-19. 
Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming11,12,14,20,21) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent&#8217;s saline20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses20, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.
An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol8,10,20,24,25. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

<table><tbody><tr><td>C. elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plates, triple vented</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Other plate brands will suffice.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 ml (1 M) CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 25 ml (1 M) KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH=6, 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Various</td><td></td><td>&lt;I&gt;e.g.&lt;/I&gt;, Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Incubator</td><td>Various</td><td></td><td>For drying agar</td></tr><tr><td>Digital balance</td><td>Various</td><td></td><td>For determining plate weights and agar volume</td></tr><tr><td>Copper rings</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td><td>1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>This camera has a large field of view.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Discontinued model, M60 is current equivalent.</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>3&amp;rdquo;x3&amp;rdquo;&amp;nbsp; backlight for even illumination across the field of view</td></tr><tr><td>Imaging and tracking software</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Newer versions of the software have tracking functions.</td></tr></tbody></table>

an assay for measuring the effects of ethanol on the locomotion speed of caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

여러 가지 유전자형과 짝을 컨트롤에서 대표 데이터 (그림 1)는 8,24을 제시; 데이터는 구체적으로 분석 동물에서 그 하이라이트 차이를 선정 하였다. 노출 10 분으로 영향 정도는도 1B-G의 좌측 축 상에 도시되어 균주의 초기 감도 여겨진다. 10 분으로 제어보다 큰 상대 속도와 변이주가, 에탄올 (도 1F, G) 내성 인 것으로 간주되는 반면 (도 1D ...

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An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

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Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

8.6K 조회수.  Virginia Commonwealth University. C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay. 

비디오: An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

파리에서 에탄올 민감도를 측정하는 간단한 방법

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

연구

신경과학

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

유전학

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

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Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

행동분석학

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

에탄올 진정 감도 및 신속한 공차 측정을위한 저렴하고 확장 가능한 행동 분석<em&gt; 초파리</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

생물학

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Touch Habituation Assay: A Method to Study Non-Associative Learning in C. elegans

Source: Mersha, M. D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56771/long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to">Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video introduces the touch habituation assay, a C. elegans behavioral method of assessing mechanosensation and quantifying time to habituation.

터치 습관화 분석: 예쁜꼬마선충의 비연관 학습을 연구하는 방법

Source: Mersha, M. D., et al. Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants. J. Vis. Exp. (2018).
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Caenorhabditis elegans (worm)

Behavior

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

의 로코 속도에 에탄올의 효과를 측정하는 분석

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터치 습관화 분석: 예쁜꼬마선충의 비연관 학습을 연구하는 방법

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법