R01AA016837 (JCB) und P20AA017828 (AGD und JCB): Diese Studien wurden durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, Nationales Institut für Alkoholmissbrauch unterstützt.

1. Schritte für den am Tag vor dem Test durchführen <ol><li> Wählen L4 Stadium Würmer an die frische Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten ausgesät mit einem Rasen von OP50 E. coli und Kultur sie bei 20 CO / N. Jeder Test Zustand erfordert 10 Würmer; holen einen Überschuss von Würmern für O / N-Verlust von Würmern ermöglichen. <ol><li> Nur Tiere, die erste Test-Tag Erwachsene sind; viele Mutanten wachsen mit einer geringeren Geschwindigkeit als der Wildtyp. Stellen Sie den Zeitpunkt der Kommissionierung für Stämme, die Entwicklungsverzögerungen haben, so dass alle getesteten Tiere ersten Tag Erwachsene. </li></ol></li></ol> 2. Schritte für den am Tage der Durchführung des Tests <ol><li> Vorbereitung für den Test: <ol><li> Führen Sie Tests auf Standard ungeimpften 60 x 15 mm NGM-Platten. Trocknen Sie alle Platten bei 37 C für 2 h verwendet werden, mit Deckel aus. Für jede experimentelle Studie, verwenden Sie vier getrocknete NGM-Platten; diese werden die 0 mM und 400 mM Ethanol Assay-Platten und die sie begleitenden Akklimatisierung Platten sein. HINWEIS:Die Verwendung von NGM-Platten ist es wichtig, Unterschiede in der Zusammensetzung der Platten, insbesondere deren Osmolarität kann stark Einfluss auf die Dosis-Antwort von Ethanol auf Verhalten ist dies aufgrund, zumindest teilweise auf Änderungen in der Menge von Ethanol von den Tieren 20 akkumuliert. NGM-Agar ist 160 mOsm. </li><li> Nach dem Trocknen wiegen jede der ungeimpften NGM-Platten, um im Assay verwendet werden und das Gewicht. Bestimmen das Volumen der Medien in den Platten basierend auf dem Gewicht einer leeren Platte. Um die Umwandlung des Gewichts des Agars zu Volumen anzunähern, davon ausgehen, dass die Medien wiegt das gleiche wie ein gleiches Volumen Wasser. HINWEIS: Unsere beständigsten Ergebnisse wurden mit NGM Medien, die ausreichend entwässert hat, dass ein Original 10 ml Volumen hat eine Nachtrocknungsvolumen zwischen 8,3 bis 8,9 ml gefunden. Eine Alternative zu der 2 Stunden Trockenzeit ist, um zu trocknen, bis die Platten erreichen diesen Volumenbereich, um Unterschiede in Inkubatoren ausmachen. </li><li> Schmelze 4 Kupferringe (Innendurchmesser von 1.6 cm) in der Oberfläche jeder der Platten als Hürden für die verschiedenen Genotypen oder Behandlungsgruppen worms.Grasp jeder Ring mit einer Zange und Hitze in einer Flamme (eine starke Flamme eines Bunsenbrenners funktioniert gut) für etwa 3 handeln sec. Sofort legen Sie den Ring auf einer Platte, während immer noch den Ring mit der Zange, um sie von &quot;Überspringen&quot; zu verhindern. <ol><li> Sicherzustellen, dass der Ring ruht flach auf der Oberfläche des Agars durch Herunterdrücken mit der Zange an mehreren Stellen auf dem Ring. Beim Anbringen des Rings, seien Sie vorsichtig, um Platz für weitere drei Ringe zu verlassen. </li><li> Schmelzen die drei zusätzlichen Kupferringe in die Oberfläche der Platte, wobei darauf zu ihnen so nahe wie möglich beieinander zu platzieren, so dass alle vier werden in das Sichtfeld der Kamera sein. HINWEIS: Erstellen Sie eine gute Abdichtung mit dem Agar ist wichtig, um die Würmer in den Ringen während des Tests zu halten. Ringe, die um überspringen auf der Platte ist unwahrscheinlich, dass die korrekte Abdichtung mit dem Agar zu machen undkann das Agar, der Würmer zu graben können und stört die Visualisierung der Würmer Narbe. </li><li> Für jede Testplatte vorbereiten eine begleitende &quot;Akklimatisierung&quot; Platte, die getrocknet werden sollte und ungeimpften und kein Ethanol erhalten. Zeigen vier Kupferringe auf diesen Platten. </li></ol></li><li> Kennzeichnen die Unterseite der Platten neben jeder Ring mit dem Wurmstamm, in den Ring eingesetzt werden, wobei darauf zu nicht im Sichtfeld der Ring selbst schreiben. Bringen Sie die Etiketten auf der Testplatte mit der dazugehörigen Akklimatisierung Platte. </li><li> Berechnen der Menge von 100% igem Ethanol zu jeder Testplatte hinzuzufügen, so dass die Endkonzentration 0 mM oder 400 mM Ethanol (Gewicht zu Volumen). Für jedes Experiment (n = 1), wird eine 0 mM und eines 400 mM Ethanol Platte sein; Akklimatisierung Platten erhalten keine Ethanol. Hinzufügen des Ethanols Pipettieren sie um die Oberfläche der Platte. Verwenden Labor Film, um die Platte zu versiegeln und lassen Sie es auf der Tischplatte für 2 Stunden ins Gleichgewicht. </li><li> Wenn 1,5 Stunden verstrichen ist, beginnt der Akklimatisierungsschritt des Assays, Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Führen Sie die Fortbewegung Test: Testplatten <ol><li> Sorgfältig über 10 Würmer von jeder Versuchsgruppe zum Zentrum von einem Kupferring auf der Akklimatisierung Platte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die durch Kratzen leicht mit dem Wurm Pick auf dem Agar an dieser Stelle zu sehen ist. Variiert die Reihenfolge, in der die Versuchsgruppen werden auf den Platten in experimentellen Studien legen, so dass die gleichen Stämme werden auf den Platten in der gleichen Reihenfolge in den Studien legen. HINWEIS: Das Ziel ist es, die Tiere auf dem Teller mit minimalen Mengen von Lebensmitteln zu übertragen, denn wenn Lebensmittel auf dem Akklimatisierung Platte an der Testplatte übertragen die Würmer zu aggregieren um das Essen und die Wirkung des Medikaments auf die Fortbewegung wird verdeckt werden. </li><li> Achten Sie darauf, die Oberfläche des Agar mit dem Pick zu brechen, da dies ermöglicht es die Würmer zu graben und den Test zu unterbrechen. Die Würmer bei RT inkubieren für 30 Minuten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es eine entsprechende Abstand zwischen den Einweihungen jeder Platte. Ein erfahrener Experimentator 40 Tiere, 10 / ring für 4 Ringe in &lt;1,5 min bewegen, aber jedes Intervall von bis zu 2 Minuten ist akzeptabel. Der Standardtest hat Filme Aufnahme bei 10-12 min und 30 bis 32 Minuten der Exposition sowohl für 0 mM und 400 mM Ethanol. </li><li> Initiieren Sie die Akklimatisierung Platte für die 0 mM Belichtung und der Akklimatisierung Platte für die 400 mM Exposition ca. 2 min und 30 s auseinander, um für das Speichern der ersten Film-Datei, bevor der zweite Film müssen anfangen können. </li><li> Nach dem 30-Minuten Eingewöhnungszeit, übertragen Sie die Würmer aus den Akklimatisierung Platten zu den Testplatten. Übertragen Sie die Würmer zu den Testplatten (0 mM oder 400 mM Ethanol) in der gleichen Reihenfolge, dass sie auf die Akklimatisierung Platte gegeben, die Verfolgung des Zeitpunkts zwischen den Fertigstellungen jeder Platte. Verschließen Sie die Platte mit Labor Film, um den Verlust von Ethanol zu Verdampfung zu minimieren. </li><li> Use eine Schöpfbewegung mit einer dünnen Kanten abgeflacht Wurm Pick Würmer auf der Oberseite des abgeflachten Pick sammeln. Wird die Übertragung von Würmern aus dem ungesetzten Akklimatisierung Platte an der Testplatte ohne die Verwendung von Bakterien, die üblicherweise bei der Übertragung Würmer verwendet wird, da es hilft, die Schnecke zu der Aufnahme kleben. HINWEIS: Die Geschwindigkeit, mit denen die Tiere in diesem Schritt transferiert ist sehr wichtig, weil die ersten Würmer auf der Platte länger als die letzten Würmer zu der Platte zugegeben, um Ethanol ausgesetzt werden, und früheren Zeitpunkten können einige zeitabhängige Wirkung. Dies ist der Hauptgrund für die dreh Stämme werden auf einer Platte zuerst über Experimentwiederholungen gesetzt. </li></ol></li><li> Führen Locomotion Assay: Die Dreharbeiten <ol><li> Mikroskop verwenden / Kamera-Kombination, die für die gleichzeitige Darstellung aller vier Ringe in dem Sichtfeld (ca. 42x42 mm 2 Quadrat), ermöglicht, wie einem Mikroskopobjektiv 0,5x, 0,8x Vergrößerung und einer Kamera mit einer Auflösung von 2048x2048 7,481; m Pixel-CCD. </li><li> Verwenden Sie gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld, das in der Objekterkennung in der Intensitätsschwelle Schritt unterstützt (siehe unten). A 3 &quot;x3&quot; Hintergrundbeleuchtung funktioniert gut. </li><li> Bild die Würmer auf einer Platte positioniert Medienseite nach oben (Deckel nach unten), der Kontrast, die bei der Verwendung der Hintergrundbeleuchtung im Vergleich zu einem herkömmlichen Mikroskop Durchlichtquelle verloren wird erzeugt. </li><li> Bereiten Sie die Bildanalyse-Software, um Zeitraffer-Filme der sich bewegenden Würmern zu erfassen. Legen Sie die Software zur Erfassung 12-Bit-Graustufenbilder alle 1 Sek, als 2-min (120 Rahmen) Film. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren, doch behielt er ausreichende Bildauflösung, mit einem 2x2 Binning-Modus zu 1024x1024 Pixel Bilder zu fassen. </li><li> Notieren Sie sich die Filme. Beginnen der Aufzeichnung eines 120-Rahmens Film der ersten Platte (0 mM Ethanol) 10 min nach der letzten Würmer wurden auf dieser Platte angeordnet. Speichern Sie die Videodatei. </li><li> Notieren Sie sich die zweite Platte (400 mM Ethanol). Wiederholen Sie diesen Vorgang fürbeide Platten ab 30 Minuten nach der letzten Würmer wurden auf der ersten Platte (0 mM Ethanol) platziert, um die 30 bis 32 min Zeitpunkten für jedes Engagement mit ein. HINWEIS: Lassen Sie ausreichend Zeit, um die Bilddateien nach jeder Aufnahme-Session, bevor die Aufnahme beginnt die nächste Platte zu analysierende speichern. </li><li> Für Zukunftssicherheit der archivierten Filme und, damit diese Filme zu öffnen und von anderen öffentlichen Bereich Open-Source-Bildbearbeitungssoftware-Programmen wie ImageJ 28 analysiert werden, wandeln eine Kopie jeder Film in 8-Bit 256 Graustufen TIFF-Dateien. HINWEIS: Die hier beschriebene Bildanalyse-Software ein proprietäres Dateiformat verwendet. </li></ol></li><li> Die Analyse der Filme mit ImagePro Software. <ol><li> Einmal erfasst, analysiert die Filme mit Hilfe von Image-Pro Plus-Software oder den Gegenwert. HINWEIS: Eine Vielzahl von anderen Objekt-Tracking-Software zur Verfügung, die verwendet wurde, um mehrere C erfolgreich verfolgen elegans zu einem Zeitpunkt 29 und solchenSoftware könnte einem angemessenen Ersatz für die hier beschriebene, da die Objektidentifikation Schritte auf ähnlichen Prinzipien. Das beschriebene Verfahren bezieht sich auf Image-Pro Plus-Software-Versionen von 6,0 bis 6,3 und 7,0, neuere Versionen von Image-Pro Plus-Software kann geringfügige Unterschiede haben. </li><li> Analysieren Sie Filme in 2-min (120 Rahmen) Segmenten. Erstens, einen Filter auf die Bilder, um den Hintergrund glätten und verbessern Sie den Kontrast der Wurm Objekte. Wählen Sie den Filter wie folgt: Menü&gt; Prozess&gt; Filter&gt; Zubehör&gt; Flatten: Parameter: Hintergrund = Dunkel; Verfügen Breite = 20 Pix. </li><li> Re-speichern Sie die Filme nach dem Filterschritt, sondern auch in der Originalfilm in seiner ungefiltert zu erhalten. <ol><li> Analysieren der Fortbewegung eines Tiere in jeder Ring getrennt mit einem kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI), der angeordnet ist und bemessen ist, um mit dem Kupferring überlappt. Identifizieren und verfolgen die Würmer mit dem Menü&gt; Messen&gt; Track Objects ... Befehl; Dadurch wird das Tracking-Data Tabellenfenster. Der Button-Tracking-Optionen können bestimmte Titel ausgeschlossen werden und zu experimentellen Artefakte begrenzen. </li></ol></li><li> Unter dem Reiter Auto Tracking, verwenden Sie die folgenden Parameter: Spur-Parameter: Geschwindigkeits-Grenzwert (Suchradius) = 400 &amp; mgr; m / Rahmen, Beschleunigungsbegrenzung = Auto, Mindestgesamtstreckenlänge = 400 &amp; mgr; m Wiegende Bewegung type = chaotisch; Objekte in Spuren Parameter: Lassen Teilspuren = yes, Mindestlänge = 21 Frames, Kamera Vorhersage Tiefe = 1 Frame. </li><li> Um die Verfolgung einzuleiten, klicken Sie auf Suche Alle Titel automatisch funktionieren um das Dialogfeld Count / Größe Optionen und das Dialogfeld Verfolgung aufzurufen. Wählen Sie die Option Manuell für die Intensitätsbereichsauswahl im Dialogfeld Count / Größe, die die wichtige Schwelle Schritt, der die Graustufen-Intensität der Wurm Pixel verwendet, um einen Wurm Objekt zur Analyse hervorheben und die helleren Hintergrund Pixel ignorieren bietet. <ol><li> Stellen Sie die Intensität Schwelle sliders (eine, die obere Grenze gesetzt, ein, um die untere Grenze gesetzt), um einen inklusiven Bereich, die alle dunklen Objekten unterstreicht erstellen. Ein Bereich von 0-1,500 auf einer Skala von 0-4,095 ist ein guter Ausgangspunkt für die Feinabstimmung. </li><li> Anwenden einer Filtergröße von Objekten, die größer und kleiner als eine einzige Schnecke Objekt, wie dem Kupferring und Schutt auf den Platten aus. Stellen Sie zwei Größenparameter dazu, die Größen für den individuellen Würmer decken in einer Vielzahl von Körperhaltungen mit der Maßnahme zu tun&gt; Wählen Messungen Menüpunkt im Dialogfeld Count / Größe angezeigt werden. (Bereich Bereich: 28,000-120,000 um 2 und Perimeter Bereich: 600-2,500 um). </li><li> Wenn ein Mutantenstamm ist wesentlich kleiner oder größer als andere Tiere auf dem Teller zu analysieren, erweitern den Bereich der Filtereinstellungen für die Objekterkennung, um die verschiedenen Größen der Stämme, bevor die Verfolgung von Tieren unterzubringen, so dass Einstellungen nicht geändert werden müssen Mitte der Analyse. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Füllen Sie das Tracking-Prozess, indem Sie auf Weiter im Dialogfeld Verfolgung. Visuell vergleichen die Ausgangsspuren mit dem Fortschritt der einzelnen Wurm in dem Film, um zu gewährleisten, dass jeder Wurm vertreten ist, es sei denn es gibt einen triftigen Grund, basierend auf den automatischen Filtereinstellungen, um sie auszuschließen. Spuren, die durch die Anwesenheit von nicht-bestätigten Schnecken Objekte, die die Größe Filterkriterien erfüllt hergestellt wurden manuell zu löschen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um die Geschwindigkeit eines jeden Wurm zwischen den einzelnen Bildern berechnen (zurückgelegte Strecke für den Schwerpunkt eines Objekts pro 1 Sekunde zwischen den Rahmen) und zeigt die Durchschnittsgeschwindigkeit für jede Spur und die Durchschnittsgeschwindigkeit über alle Spuren für die Bevölkerung von Würmern in der Kupferring. Betrachten Sie diese endgültige Durchschnitt n = 1 in Bezug auf die experimentellen Studien sein. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm für statistische Auswertungen und Datenarchivierung. </li><li> Nachdem die Daten für das erste Ring auf der Platte aufgezeichnet wurden, bewegen Sie den ROI auf die nächste Ring undwiederholen Sie den Tracking-Prozess, ohne Änderung der Parameter. </li><li> Berechnen Sie die relative Geschwindigkeit der Fortbewegung durch: </li><li> Relativgeschwindigkeit (%) = behandelt (400 mM) Geschwindigkeit / unbehandelt (0 mM) Geschwindigkeit x 100. HINWEIS: Verschiedene genetische Manipulationen verändern oft die basale Fortbewegungsgeschwindigkeit der Tiere. Um die Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Tieren zu bestimmen und in der Lage, diese Effekte in verschiedenen Genotypen oder Bedingungen zu vergleichen, die Berechnung einer Relativgeschwindigkeit. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die einfache Neurobiologie und genetische Werkzeuge zur Verfügung, in C. elegans machen die Schnecke ein ausgezeichnetes Modell, in dem die molekularen Grundlagen der Auswirkungen von Ethanol auf Eigenschaften zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen Assay, der verwendet wurde, um mehrere molekulare und Umweltmediatoren der akuten Verhaltensreaktion zu Ethanol 8,10,20,24,25 identifizieren. Diese Methode erlaubt die Differenzierung und der gleichzeitigen Prüfung von zwei verschiedenen Ethanol Ansp...

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by na&#239;ve drinkers3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components6. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.
The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals10-16, and have been implicated in abuse liability in humans17-19. 
Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming11,12,14,20,21) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent&#8217;s saline20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses20, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.
An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol8,10,20,24,25. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x15 mm Petri plates, triple vented</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628161</td>
			<td>Other plate brands will suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM agar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>NaCl (3g/L), agar (17g/L), peptone (2.5g/L), 1 mL cholesterol (5mg/mL in ethanol), 1 mL (1M) MgSO4, 1 mL (1M) CaCl2, 25 mL (1M) KPO4, pH=6, 975 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Fisher Scientific #10300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For drying agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital balance</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For determining plate weights and agar volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper rings</td>
			<td>Plumbmaster</td>
			<td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td>
			<td>1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>RET-4000R-F-M-12</td>
			<td>This camera has a large field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Discontinued model, M60 is current equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>A08923</td>
			<td>3&#8221;x3&#8221;&#160; backlight for even illumination across the field of view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging and tracking software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td>
			<td>Newer versions of the software have tracking functions.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for measuring the effects of ethanol on the locomotion speed of caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

Repräsentative Daten (Figur 1) aus mehreren verschiedenen Genotypen und ihrer gepaarten Bedienelemente vorgestellt 8,24; Daten wurden speziell ausgewählt, dass Highlight Unterschiede in den untersuch Tiere. Der Grad der Wirkung bei 10 Minuten der Exposition wird als die anfängliche Empfindlichkeit einer Dehnung, die auf der linken Achse in 1B-G dargestellt ist. Mutanten-Stämme mit einer Relativgeschwindigkeit größer als die Kontrolle bei 10 min werden als Ethanol bestä...

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An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

8.6K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay. 

Serie: An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Ein Assay zur Durchlässigkeit des Zebrafisch-Embryos Neuroepithel

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Methods Article

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der