이 프로토콜을 통해 연구자들은 C- 엘간이 아세틸 콜린 수용체 작용제 인 Levamisole에 어떻게 반응하는지 관찰 할 수 있습니다. 변경된 Levamisole 감도는 신경근 접합부 또는 근육 기능에서 신호 전달의 결함을 암시 할 수 있습니다. 주요 이점은 Levamisole 용액에서 C- 엘간의 격렬한 수영을 통해 연구자들이 단 1 시간 만에 수백 마리의 벌레의 시간 의존적 마비를 정량화 할 수 있다는 것입니다.
5 분마다 각 우물에있는 웜의 수를 세는 것은 압도적 일 수 있습니다. 분석된 웰의 수 또는 필요한 경우 시점을 조정할 수 있습니다. 시작하려면 교반 막대가 있는 플라스크에 3g의 염화나트륨, 2.5g의 펩 톤 및 17g의 한천을 1리터의 탈이온수와 결합하여 선충 성장 배지를 준비합니다.
오토클레이빙 후 미디어를 섭씨 70도로 설정된 핫 플레이트에 놓고 적당한 속도로 1시간 동안 저어줍니다. 강수량을 방지하기 위해 밀리리터 콜레스테롤 당 5 밀리그램 1 밀리리터를 적가하십시오. 1 몰 염화칼슘 1 밀리리터, 1 몰 황산 마그네슘 1 밀리리터 및 1 몰 pH 6.0 인산 칼륨 완충액 25 밀리리터를 배지에 공급합니다.
2 밀리리터의 선충 성장 배지를 멸균 혈청 학적 피펫으로 24 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 박테리아와 함께 앉기 전에 접시를 벤치 상단에서 이틀 동안 건조시켰습니다. 단일 op 50 콜로니를 B 국물에 넣고 밤새 섭씨 37도에서 배양 진동을 설정합니다.
멸균 피펫을 사용하여 30마이크로리터의 OP50 현탁액을 각 웰 중앙에 있는 한천에 떨어뜨립니다. 박테리아 잔디가 형성되도록 접시를 앉힌 후 최소 이틀 동안 실온에 두십시오. 야생형 unc-63 Lev10 및 unc-49 C- 엘간을 6 센티미터 플레이트에서 성인으로 성장시켜 균주 당 최소 8 개의 플레이트를 준비합니다.
동기화 당일에 후드 아래에 표백 용액을 준비하십시오. 50 밀리리터의 크로니클 튜브에 표백제 10 밀리리터, 수산화 나트륨 2.5 밀리리터 및 탈 이온수 37.5 밀리리터를 섞는다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 M9 버퍼로 최소 4개의 플레이트에서 중력 벌레를 세척하고 15밀리리터 크로니클 튜브로 옮깁니다.
716 G을 실온에서 1분 동안 스핀시킨 다음, 이송 피펫을 이용하여 상층액을 제거하였다. 표백 용액 10 밀리리터를 첨가하십시오. 대부분의 벌레 시체가 녹을 때까지 튜브를 4 분 동안 부드럽게 흔 듭니다.
716G에서 1분 동안 회전합니다. 표백제를 한 번에 붓습니다. 이 시점에서 튜브가 흔들리지 않는 한 계란은 15ml의 M9 버퍼에서 튜브 측면에 달라붙어 뒤집힙니다.
716G에서 1분 동안 회전하고 M9 버퍼를 한 번의 부드러운 동작으로 붓습니다. 완충액으로 이 세척을 3회 반복한다. 최종 세척 후 신선한 M9 10ml를 넣고 섭씨 15도에서 밤새 회전 장치에 놓아 굶주린 첫 번째 애벌레 단계 동물의 동기화 된 개체군을 분리합니다.
24 웰 플레이트로 인쇄하고 균주를 무작위 위치에 할당하십시오. 표백제 준비 후 약 24시간 후, 부화한 굶주린 L1 벌레를 716G에서 실온에서 1분 동안 스핀다운합니다. 플라스틱 이송 피펫으로 약 9밀리리터의 M9 버퍼를 제거한 다음 나머지 M9 버퍼에 굶주린 첫 번째 유충 단계 벌레를 부드럽게 혼합합니다.
즉시 3마이크로리터의 웜과 M9 버퍼를 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 L1의 수를 결정합니다. 원하는 수는 3 마이크로 리터에서 20-30 L1입니다. 미리 만들어진 플레이트 맵에 따라 각 웰에 3 마이크로 리터의 L1을 피펫팅하고 벌레가 섭씨 20도에서 3 일 동안 성충으로 자라게합니다.
1시간 동안 5분마다 각 웰에서 이동하는 웜의 수를 기록하는 데 사용할 빈 데이터 시트를 인쇄합니다. 24 웰 플레이트에서 웜을 확인하십시오. 마커를 사용하여 오염되었거나 굶어 죽거나 벌레가 너무 많아 계산이 어려운 우물 위의 플레이트 뚜껑에 X를 만드십시오.
M0.4 밀리리터에 100 밀리몰 레바 미솔 스톡 200 마이크로 리터를 추가하여 9 밀리몰 레바 미솔 용액을 만듭니다. 타이머를 시작한 다음 이송 피펫을 사용하여 처음 두 우물에 0.4 밀리몰의 levamisole 1 밀리리터를 추가하여 동물이 자유롭게 수영하도록합니다. 인접한 우물에 Levamisole을 계속 추가하여 분석 할 우물 수에 따라 시간을 엇갈리게하십시오. 5분에 첫 번째 웰부터 시작하여 각 웰에서 움직이는 웜의 수만 수동으로 계산하고 해당 수를 데이터 시트에 기록합니다.
1 시간 동안 5 분마다 각 우물에서 움직이는 벌레의 수를 계속 세십시오. 분석이 끝나거나 시간이 허락하면 각 우물의 총 웜 수를 기록하십시오. 플레이트를 얻고 각 웰에 해당하는 균주를 매핑하고 기록합니다.
각 웰의 총 웜 수로 시작하여 유전자형별로 구성하는 스프레드시트에 데이터를 입력합니다. 우물의 데이터를 결합하여 각 시점에서 움직이는 웜의 수를 결정하십시오. 이를 사용하여 각 시점에서 마비되는 숫자를 계산합니다.
왼쪽 열에 시간이 표시되고 후속 열에 각 변형에 대한 데이터가 포함되도록 데이터 테이블을 만듭니다. 처음 5 분 이내에 마비 된 각 동물에 대해 행을 만들고 5 분 동안 하나를 입력하십시오. 각 시점에 대해 이 작업을 반복합니다.
분석이 끝날 때까지 마비되지 않는 모든 동물의 경우 60 분 동안 0을 입력하십시오. 이러한 데이터를 사용하여 여기에 사용된 특정 통계 소프트웨어에서 생존 곡선을 생성하여 모집단의 시간 종속 마비를 시각적으로 표시합니다. 분석된 모든 균주에 대한 데이터는 필요에 따라 공백을 남겨두고 동일한 데이터 테이블에 입력해야 합니다.
레바 미솔 아세틸 콜린 수용체의 서브 유닛의 돌연변이뿐만 아니라 시냅스 후 레바 미솔 민감한 아세틸 콜린 수용체의 클러스터링에 필요한 유전자의 돌연변이는 각각 unc-63 및 Lev-10 돌연변이에서 관찰 된 바와 같이 레바 미솔 유도 마비에 대한 내성을 유발합니다. GABA 게이트 이온 채널 unc-49의 손실은 콜린성 및 GABA 성 신호 전달의 적절한 균형의 붕괴로 인해 레바 미솔 과민증을 유발했습니다. 24웰 플레이트의 적절한 준비가 필수적입니다.
L1을 발견하기 전에 박테리아 잔디가 건조하지 않으면 분석 중에 Levamisole 용액이 흐려져 관찰을 방해 할 수 있습니다. 24 웰 플레이트를 변형시킴으로써, 이 프로토콜은 RNAi 녹다운된 동물로 수행될 수 있다. 이를 통해 연구자들은 돌연변이를 사용할 수없는 C- 엘간의 유전자를 연구 할 수 있습니다.
