우리는 교수의 명예 장 클로드 Perriard과 에블린 Perriard 신생아 쥐와 쥐 심근을위한 절연 기술에 도입 (기술, 스위스 스위스 연방 공업 대학)에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 교수 후아 첸 교수 실비아 에반스 (UCSD, 미국)에게 감사의 말씀을 전합니다. EE의 실험실에서 작업 MRC 경력 설립 교부금에 의해 투자되었다. SL은 NIH / NHLBI (HL107744)에서 독립 수상에 K99/R00 경로에 의해 지원된다. TMM은 미국 심장 협회 (American Heart Association, 11POST7310066)에서 박사 학위 취득 후 친교에 의해 지원되었다.

다음 절차는 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 대한 이틀간의 프로토콜 (16, 17)에 대해 설명합니다. 모든 솔루션은 살균 또는 멸균 필터링됩니다. 모든 공구는 75 %의 에탄올로 표면을 살균 소독한다. 초기 티슈 추출을 제외하고, 모든 단계는 무균 층류 세포 배양 후드에서 수행된다. 이 프로토콜은 하나, 둘, 쓰레기 (들)에서 신생아 마우스 마음의 분리를위한 것입니다 - 약 5-14 새끼,하지만 더 큰 쓰레기의 크기와 쥐 신생아 심근을 위해 구성 될 수있다. 적절한 규모의 미디어 / 효소 사용. 신생아 설치류와 작업의 경우, 의회 및 / 또는 동물 관리 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학 지침 및 규칙을 참조하여 제도적으로 승인 된 동물 프로토콜을 준수. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을, 그리고 FEDE에 부착 된RAL 및 주 규정. 1 일. 1. 신생아 쥐의 심장 조직의 분리 <ol><li> 20 mM의 BDM 6-8로 보충 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS 50 ㎖를 준비하고, 얼음에 배치 된 두 개의 멸균 세균 요리에 분산. </li><li> 50 ㎖ 멸균 원뿔 팔콘 튜브에 격리 매체의 10 ㎖를 준비합니다. 얼음에 모든 솔루션을 유지합니다. 그리고 집게 (곡선, 뒤몽 7 번), 가위 (하나의 직선 곡선을) 소독. </li><li> 1-3일 된 신생아 마우스는 표면 살균에 대한 75 %의 에탄올 용액에 신속하게 세척된다. 새끼는 멸균 가위 (직선)을 사용하여 참수하고, 가슴은 흉강에 대한 액세스 및 심장 (그림 1A, 보충 영화 S1)을 허용하는 흉골을 따라 열립니다. 기술 코멘트 : 3 일 이전의 신생아 마우스는 사용하지만, 적은 가능한 세포 2 발생할 수 있습니다. </li><li> 하츠에서 추출곡선 가위로 몸과 20 mM의 BDM과 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 박테리아 접시에 즉시 전송, 얼음. 모든 다음 단계는 무균 세포 문화 후드에서 수행됩니다. </li><li> (원하는 경우, 및 심방) 폐 조직, 큰 혈관을 제거합니다. 1X PBS 용액에 세척 하트 (칼슘없이 2 +, Mg를 2 +) 20 mM의 BDM (얼음)와 혈액을 제거합니다. 전송 20 MM (얼음) BDM 집게를 사용하거나 구멍 스푼 (그림 1B)와 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 두 번째 박테리아 접시에 첫 번째 접시에서 마음을 씻어. </li><li> 전송 청소 / 절연 매체의 드롭 (약 250 μL, 그림 1C)에 마음을 세척 (얼음) 세 번째 박테리아 접시에 작은 조각 (약 0.5 mm 3 이하로 마음을 말하다 곡선 가위를 사용한다; 그림 1D, 1E). </li><li> 원추형으로 다진 마음을 전송튜브 (얼음) 절연 매체의 10 ㎖를 포함, 밤에 4 ° C에서 교반과 함께 배양한다. </li></ol> 2 일. 2. 세포의 효소 조직 소화 도금 <ol><li> 콜라게나 / 디스 파제 혼합물 (로슈)의 15 밀리그램의 무게를, 20 mM의 BDM (소화 매체)로 보충 10 ㎖ L15 매체 5 효소 믹스를 녹입니다. 살균 필터 새로운 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 세포 배양 후드에서 소화 매체. </li><li> 30 ML L-15 20 mM의 BDM 보충 매체와 도금 매체를 준비합니다. </li><li> 1 시간의 최소 콜라겐 용액 (시그마 C-8919)를 가진 외투 세포 배양 플레이트. 멸균 층류 세포 문화 후드에 콜라겐 용액 (재사용 할 수있는) 건조 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시를 제거합니다. </li><li> 4 ℃에서 predigested 마음을 포함하는 원뿔 튜브를 제거 조직의 조각 (그림 1G)을 집계해야합니다. 조직 단편에 싱크하자튜브의 바닥 (모든 조직의 조각을 느슨하게하지 않도록하십시오., 일반적으로, 절연 매체의 약 1 ㎖ 튜브에 남아있을 수 있습니다) 뜨는을 제거합니다. 소화 배지 5 ㎖를 1 분 동안 산소 또는 공기를 이용하여 조직 절편 및 옥시 현탁액에 20mM의​​ BDM 보충 된 L-15 5 mL를 추가. </li><li> 소화 용액의 온도를 조절하기 위해 약 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 소화 매체에서 심장 조직의 조각을 포함하는 밀봉 원뿔 튜브를 전송합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 동안 교반과 (60RPM 이하 이상으로 설정 37 ° C에서 예를 들어, 셰이커,)와 37 ° C에서 심장 조직의 조각을 품어. . 소화 시간은 크게 효소 혼합물 및 로트 번호주의에 따라 달라질 수 있습니다 : 더 이상 부화 기간 이상 효소의 농도는 세포 생존 능력을 감소시킬 수있다. </li></ol> 기술 코멘트 : 102696 : 우리는 (Cat.No. 로슈에서 콜라게나 / 디스 파제 혼합물의 사용을 추천합니다38001)이 아주 작은 로트의 변화가 있습니다. 마우스 심근의 분리를위한 고전적인 효소 트립신 및 / 또는 워딩 턴 (고양이 없음 CLS-2)에서 사용 가능한 콜라게나 제 II 형 3,16-20입니다. 그러나, 콜라게나 II의 성능은 로트에서 실질적으로 다를 수 있습니다. 워딩 턴은 일반적으로 소화 시간을 최적화하고 사용을 효소 몇 가지 콜라게나 많이 테스트 할 수 있습니다. 대안 적으로, 워딩은 사전 테스트 효소 혼합물로 심근 분리 키트를 판매하고 그 마우스 심장 근세포 17 (: NCIS 카탈로그 번호)의 분리를 위해 적응 될 수있다 포함. <ol start="7"><li> 신선한 멸균 50 ML 원뿔 팔콘 튜브에 멸균 세포 스트레이너 (40 ~ 100 μm의 나일론 메쉬)를 놓습니다. 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15와 사전 젖은 셀 스트레이너. 10 ~ 20 회 미리 침수 10 ㎖ 세포 배양 피펫을 사용하여 부드럽게 씹다 조직 조각. 조직 단편을 주로 suspensio로 세포를 방출이 단계 중에 분산해야N (그림 1H). </li><li> 큰 조직 파편이 침전하자 세포 스트레이너 (그림 1I)를 통해 신선한 원뿔 튜브에 중단 세포를 포함 뜨는 전송. </li><li> 5 ㎖의 소화 매체에 소화되지 않은 조직의 조각을 다시하면 일시 중지 및 교반과 함께 37 ° C에서 추가로 5 ~ 10 분 동안 품어. </li><li> 남아있는 조직 조각의 지속적인 소화 한 후, 가볍게 10 ~ 20 회 조직을 씹다 첫 번째 셀 스트레이너를 통해 다이제스트에서 원뿔 튜브 포함하는 셀을 추가 할 수 있습니다. 모든 소화 세포의 통과를 허용하는 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15 세포 스트레이너를 씻어. </li><li> Centrifugate 원뿔 튜브 300 rpm에서 5 분 (약 50 ~ 100 XG)에 대한 중단 심근을 포함. (대부분 섬유 아 세포와 내피 세포를 포함) 상층 액을 제거하고 매체를 도금 10 ㎖에 다시 중단 세포 펠릿. </li><li> 10cm의 세포 배양 접시 (그림 2A)로 1 부화 플레이트 세포세포 배양 인큐베이터에서 -3의 시간. 이 사전 도금 단계는 코팅되지 않은 세포 배양 접시 (그림 2C)에 부착되는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포 (그림 2B)를 제거합니다. </li><li> 배양 후, 전송 재현 탁 세포는 멸균 원뿔 팔콘 원심 분리 관 (15 ㎖를 50 ㎖)에 (반복 접시 위에 도금 매체를 피펫으로 다시 중단 세포) 10cm 배양 접시에서 비 부착 심근을 씻어. 선택 사항 : 세포 현탁액에서 추가 섬유 아 세포를 제거하는 사전 도금 단계를 반복합니다. 필요하다면, 접착 섬유 아세포 및 내피 세포 배양 일 수있다. </li><li> (노이 바 우어의 혈구를 사용하여 예를 들어, 21를 염색 블루 배제 트리 판) 세포를 계산합니다. </li><li> cm 2 (그림 2D 당 약 1.5 × 10 5 세포의 밀도 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 플레이트 세포, 볼은 도금 표 1 코멘트및 코팅). 세포 배양 인큐베이터에 요리를 놓고 준수 및 심근의 확산 수 있도록 12 ~ 18 시간 동안 그대로 둡니다. </li></ol> 3 일 - 신생아 심근의 문화 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 유지 보수 매체 prewarm를 준비합니다. 신생아 마우스 심근의 리포좀 형질에 대한 증식 억제 또는 chronotropic 에이전트의 추가, 또는 절차에 대한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li><li> 어느 날 도금 후 심근 세포의 배양 접시에 부착하고 최적의 계약을 자발적으로 시작해야합니다 (그림 2E, 2F를, 보충 영화 S2; 분리 / 배양 절차를 수행하는 동안 일반적인 문제에 대한 표 2 참조). 추가 1-5일에 대한 유지 보수 매체와 문화 매체를 도금 교체합니다. 필요에 따라 매체를 변경합니다. </li></ol>

심장 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 심장 혈관 연구에서 표준이되었습니다. 이 모델의 가까이 생화학 적 특성 (즉, 생화학 적 또는 생체 역학적 인 자극에 심장 세포의 직접 응답을 공부)은 일반적으로 심장 조직이나 심근의 분리가 필요합니다. 심장의 생리적 반응을 조사 연구는 생체 (예를 들어 40 아세틸 콜린, 또는 허혈 - 재관류 시나리오 41)은 일반적으로 ?...

쥐의 심장 세포의 성공적인 해리와 문화에 대한 최초의 보고서는 다시 1960 년대 1, 2로 거슬러 올라갑니다. 그렇다하더라도, Harary 및 팔리 배양 심근는 &quot;주기적인 수축의 요구 사항의 연구를위한 독특한 시스템을 제공 할 수있다 [월] [치는] 프로세스의 다양한 대사 경로의 기여를 결정하는 수단을 제공하는&quot;것으로 나타났습니다. 젊은 쥐, 원래의 프로토콜에서 Harary 및 팔리 격리 배양 심근 수년에 걸쳐 적응 많은 과학자들에 의해 수정되었지만, 일반적으로 분리 및 배양 과정은 크게 변경되지 않았습니다. 그러나, 더 나은 효소 3, 표준화 된 솔루션 4,5 및 분리 절차 동안 6-9 세포를 보호하기 위해 가역 채널 및 미오신 ATPase의 억제제 BDM의 첨가는 크게 휴대 수율 및 생존을 개선했다. 신생아 cardiomyo 대 성인cytes 신생아 생쥐 나 쥐에서 분리 배양 심근 성인 심근의 문화에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성인 마우스 또는 쥐 10에서 심근의 분리에 비해 제일, 신생아 마우스 또는 쥐 마음의 분리 절차는 쉽고 적은 비용이다. 신생아 심근 크게 세포 수율을 증가하고, 분리 한 후 칼슘 함유 배지에 재 도입에 훨씬 덜 민감하다. 성인 심근는 일반적으로 수축을 유도하기 위해 서성 필요로하지만 일반적으로, 자발적으로 도금 한 후 세포를 20 시간을 치고 결과 재분화주기 - 또 다른 큰 장점은 신생아 마우스의 심근이 더 빠른 탈분화를 받아야한다는 것입니다. 성인 심근는 형질 전환 DNA의 성공적인 전달을 위해 바이러스 성 벡터를 필요로하는 반면 신생아 심근은 더 쉽게 또한 리포좀 형질 전환 방법과 형질이다. 신생아 심장 근세포 대조적의, 성인 쥐 심근 11-13의 문화는 근원 섬유 저하 및 수축성 장치의 궁극적 인 회복의 조사를 할 수 있습니다. 성인 심근에서 이러한 특성을 형태 학적 변화는 1-2 주 기간에 걸쳐 발생합니다. 탈분화 - 재분화주기함으로써 인간의 심근 병증이 14에서 관찰 된 병리학 적 변화를 흉내 낸, 태아 유전자 프로그램의 reexpression 함께합니다. 신생아 심근 세포의 배양을 통해 성숙한 래트 심근 세포의 또 다른 장점은 오랜 시간 동안 배양 할 수있는 능력이 세포이다. 마우스 심근 대 쥐 쥐 신생아 심근의 분리 및 배양 가능한 세포의 높은 수율 증가 형질 전환 속도 등의 마우스 신생아 심근의 그 이상 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 심장 질환에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 광범위한 사용 (예를 들어 &lt;/ 엠&gt; 확장 성 심근증 15 모델과 근육 임 단백질 녹아웃 마우스) 신생아 쥐에서 유래 심근 세포의 분리 절차의 적응되었다. 신생아 래트 심근 세포 및 마우스를 분리하는 데 사용되는 프로토콜은 거의 동일하지만, 그레이트 손질 후자위한 적절한 효소 믹스의 선택에주의해야한다. 사실, 신생아 마우스의 심근이 감소 된 세포 수율과 생존의 결과로, 일반적으로 overdigestion에 더 취약합니다. 신생아 생쥐 유래 심근 신생아 래트 심장 유래의 세포에 비해 다소 작은 때문에 또한, 도금 밀도는 조정되어야한다. 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 및 생체 역학 매개 변수뿐만 아니라 myofibrillogenesis의 프로세스의 조사를 위해 많은 용도로, 배양 신생아 심근는 연구를위한 가장 다양한 시스템 중 하나가되고 있습니다체외에서 심장 세포 기능. 성공적인 분석의 첫 번째 단계는하지만, 신생아 마우스 심근를 분리 할 수​​있는 쉽고 안정적​​인 방법에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 다양한 소스에서의 방법론을 그리고 재현성 및 안정성을 위해 최적화되었다. 우리는 심근 세포 수율과 생존에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

교양 신생아 심근 긴 myofibrillogenesis와 근원 섬유의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 심근 쉽게 조사 및 조작 생화학 경로, 그리고 자발적으로 심근 박동의 생 역학적 특성에 미치는 영향에 대해 수 있습니다. 다음 2 일간의 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 우리는 쉽게, 신생아에서 마음을 해부 심장 조직을 떼어 놓다 및 심장 세포 집단에서 심근을 풍부하게하는 방법을 보여줍니다. 우리는 세포 분리에 대해 서로 다른 효소 혼합물의 사용, 세포 생존 능력에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 고립 된 심근 이후에 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 또는 생체 역학 분석의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 단지 시판되는 용액을 사용하여, 견고성과 재현성을위한 프로토콜을 최적화 효소 혼합물이 SH오우 작은 로트의 변화. 우리는 또한 심근의 분리 및 문화와 관련된 일반적인 문제를 해결하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 8 햇 신생아 생쥐 (그림 1A, 1B, 보충 영화 S1)에서 마음입니다. 세척 및 가위 (그림 1C-1 층)과 마음을 닦지 후, 조직 단편을 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 절연 매체에 predigested했다. predigestion (그림 1G)에 따라, 우리는 갓 소화 매체로 조직 조각을 전송하고, 교반과 함께 37 ° C에서 20 분 동안 조직의 조각을 배양 하였다. 얻어진 세포 ?...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.0K 조회수.  King’s College London.  기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

연구

생물학

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...