우리는이 프로토콜이 부분적으로 파생 된 원고에 대한 그들의 공헌 로빈슨 등. (12)의 저자 감사합니다.

동물의 사용은 오벌린 대학 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용하여 실험 동물 (21)의 관리에 대한 가이드에 따라 및 사용에있다. 바이러스 주입 1. 준비 참고 :이 프로토콜은 BSL-1의주의 사항을 사용합니다. BSL-2주의 사항, 일회용 실험실 코트, 장갑, 신발 커버, 눈 보호 및 미립자 호흡기를 (N95을 입력) 사용하는 경우 필요합니다. BSL-2 화합물을 취급 한 모든 개인은 지역 공공 보건 기관에 의해 미립자 인공 호흡기 테스트에 맞게해야합니다. 취급 및 바이러스 벡터의 저장에 대한 자세한 내용은 로리 &amp; Majewska (2010 년) (22)을 참조하십시오. <ol><li> 20 μL의 microcentrifuge 튜브에서 처음 사용, 나누어지는 및 저장되지 않은 바이러스에 반복되는 동결 융해를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 불필요한 오브젝트를 제거하고 70 % 에탄올로 표면을 살균하여 작업 표면을 준비한다. 1 준비AAV 폐기물 오염 제거 0 % 표백제 솔루션입니다. 작업 표면에 표백제 용액과 멸균 10 μL 주사기의 전체 비커를 놓습니다. 셋업 동안 짓 눌린 얼음 용기에 AAV와의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. </li><li> 표준 벤치 부사장으로 바이러스의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. AAV의 최소 4 μL와 10 μL 주사기를로드합니다. 로드하는 동안 microcentrifuge 관의 바닥에 대한 주사기의 끝이 구부러지지 않도록주의하십시오. 주사기에 AAV 솔루션의 4 μL에 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 10 % 표백제가 들​​어있는 비커에 빈 바이러스 튜브 폐기하십시오. 공급 업체에 의해 지정된 바이러스의 사용되지 않는 부분을 저장합니다. </li><li> 폐기물 용기에 추가로 10 %의 표백제를 추가하고 폐기물 정화 액체 폐기물을 처분하기 전에 30 분 동안 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 제도적 지침의 지시에 따라 생물 학적 용기에 모든 보호 장비 및 플라스틱 폐기물 폐기하십시오. 데코10 % 표백제를 사용하여 바이러스와 접촉에 온 모든 장비 또는 표면을 ntaminate. </li></ol> 2. 수술 <ol><li> 정위 장치에서와 전용 바이러스 처리 지역으로 지정 인접한 공간에 흡수 벤치 용지를 배치하여 수술 영역을 준비합니다. <ol><li> 수술 장치 근처 전용 바이러스 처리 영역에 10 % 표백제 폐기물 용기를 놓습니다. </li></ol></li><li> 마취의 꾸준한 수준을 유도하고 수술을 위해 쥐를 준비합니다. <ol><li> 의식 총 목적 운동 부족 손실이있을 때까지 이소 플루 란 가스 (1-3%의 범위) 및 산소 (100 %, 약 1 L / 분)의 혼합물을 함유 유도 챔버에 쥐를 놓는다. 수술을 통해 이소 플루 란 마취를 유지한다. </li><li> 6 깊은 마취가 달성되면, 약간 귀 뒤쪽에 눈 사이에서 쥐를 면도. </li><li> 대한 유도 챔버에 다시 쥐를 놓습니다추가로 1-3 분. </li><li> 이소 플루 란 마취 시스템이 정위 수술의 코 콘에 연결되어 있는지 확인합니다. stereotax에 이소 플루 란의 흐름을 시작 이소 플루 란 튜브의 마개를 엽니 다. 위에서 지정한 수준에서 이소 플루 란과 산소를​​ 유지한다. </li><li> 물린 줄에 입을 확보하고 귀 막대를 확보하여 정위 장치에서 쥐를 놓습니다. </li><li> 절개하기 전에 수술 부위에 눈 눈에 윤활제 및 betadine을 적용합니다. </li></ol></li><li> 눈에 꼬리 약 2mm를 시작 두개골의 등쪽 표면에 피부의 2.4 CM의 중간 선 절개를합니다. 두개골을 노출 피부를 후퇴. 주기적으로 건조되는 것을 방지하기 위해 조직의 수술 부위 마진 멸균 0.9 % 멸균 식염수를 주입. </li><li> 브레 그마 및 람다까지 두개골에서 삭제 막성 조직은 명확하게 볼 수 있습니다. </li><li> 두개골의 지느러미 - 복부 좌표를 측정하여 수준인지 확인브레 그마 및 람다에서. 브레 그마 및 람다에서 지느러미 - 복부 좌표 이하 0.04 mm의 차이까지 따라 정위 장치를 조정합니다. </li><li> 이 때, 2 % 내지 2.5 이소 플루 란 가스를 줄일 수 있습니다. </li><li> 좌표 rezero, 브레 그마에 드릴을 돌려 다음 원하는 중간 - 측면에 드릴을 이동하고 전후방 좌표입니다. </li><li> 홀에서 드릴이 28 G 주입 주사기위한 적절한 크기로 구멍을 만들어 0.9 mm의 드릴 비트를 사용하여 좌표. </li><li> 0.2 μL / 분의 속도로 바이러스를 전달하는 주입 펌프를 설정한다. 정위 장치의 주입 팔에 주사기를 놓고 좌표 원하는에 주사기를 내립니다. 바이러스의 원하는 양을 전달 (0.1 μL 0.8 범위). 예를 들어, 4 분에 걸쳐 AAV의 0.8 μl를 제공합니다. 참고 : 이상적인 주입 볼륨과 관심의 각 지역에서 바이러스의 전형적인 확산을 결정하기 위해 파일럿 연구를 실시하고 있습니다. <ol><li> 바이러스의 전달은 공동되면10 분 바늘 관으로 역류를 방지하기 위해 제자리에 mplete 주사기를 떠난다. 천천히 약 5mm / 분의 속도로 주사기를 올린다. 모든 좌표가 AAV 주입 될 때까지 반복합니다. </li></ol></li><li> 수술 스테이플와 코트 국소 항생제 연고와 상처를 사용하여 상처를 닫습니다. </li><li> 수술 후 통증 관리를위한 기관의 지침을 따르십시오. </li><li> 침구, 뚜껑과 적절한 간판과 새장에 쥐를 놓고 동물 시설에 쥐를 반환합니다. <ol><li> BSL-2주의에서 작업하는 경우, 기관의 지침에 의해 지정된 시간 (일반적으로 48 ~ 72 시간)을 위해 침대를 수집합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 침구를 놓습니다. </li><li> 자신의 안전한 폐기를위한 가이드 라인에 의해 지정된 모든 AAV-오염 물질 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 행동 장치 참고 : 감각 전처리 장치는 표준 적 조건화의 참으로 구성BER 스테인레스 스틸 그리드 바닥 (12 &quot;의 (L) X 9.5&quot;폭 x 11.5 &quot;H), 2 플렉시 유리 측벽 2 금속 벽. <ol><li> 2 Hz에서 번쩍 때 시각적 자극 집 등의 역할을 할 수있는 알루미늄 벽 중 하나와 같은 2.8 W 빛을 탑재합니다. 청각 자극을 제공하기 위해 챔버에 스피커를 장착합니다 (10 초, 1500 Hz에서, 78dB 순수한 음색과 10 초 78dB 화이트 노이즈). <ol><li> 식품 컵에 45 mg의 음식 알약을 제공하기 위해 식품 호퍼를 사용합니다. 식품 컵 내에서, 적외선 광전지는 동안 및 자극 및 식품 보상의 프리젠 테이션 후, 전에 음식 컵에 소요 된 총 시간을 감지합니다. </li><li> 하우스 배기 팬이 장착 사운드 감쇠 캐비닛의 챔버 (22 &quot;폭 x 22&quot;높이 x 16 &quot;D) (~ 68dB). </li><li> 데이터를 조작 적 챔버를 제어하고 취득 메드 어소 소프트웨어가 설치된 PC의 컴퓨터를 사용하십시오. 냉방 세션 동안 presenta 동안 음식물 컵 헤드와 소요 된 총 시간에 대한 데이터를 수집빛 자극 (5 초 시대)의 기 및 음식 보상 (5 초 시대)의 프리젠 테이션시. 테스트 세션 동안 (청각 자극이 종료 10 초 에포크 시작) 청각 자극의 프레 젠 테이션에 대한 응답으로 음식 컵에 소요 된 총 시간에 대한 데이터를 수집합니다. </li></ol></li></ol> 감각 전처리 패러다임 4. 개요 <ol><li> 수술 회복 후, 서서히 식품은 자유 섭식 체중의 85 %로 제한 쥐. 적절한 음식 제한 패러다임에 대한 수의학 직원에게 문의하십시오. 주 : 3 상 감각 전처리 패러다임은도 2에 도시되어있다. </li><li> 전처리 세션은 (1 단계, 매일 64 분 훈련은 4 일 연속에 걸쳐 실시) <ol><li> 청각과 시각적 자극의 전달 구성 12 혼합 실험과 현재 쥐. 간 시험 간격을 포함 각 후 평균 4.5 분 (범위 4.0 분 5.0) 그uditory 프리젠 테이션. </li><li> 10 초 동안 시험, 현재 톤 (미리 조정 자극)의 6 일, 깜박이는 빛 자극의 5 초 발표 바로 다음에. </li><li> 다른 6 시험에서 10 초 동안 혼자 화이트 노이즈 (짝 자극)을 제시한다. </li></ol></li><li> 컨디셔닝 세션 (2 단계 5 일간에 걸쳐 실시 매일 64 분 교육 세션) : <ol><li> 5 초 동안 시각적 자극 (깜박이는 빛의 자극)의 전달로 구성되어 8 시련과 현재 쥐이 45 mg의 음식 펠렛의 배달 바로 다음에. 간 시험 간격을 포함 각 시험 후 평균 7 분 (범위 6.0 분, 8.0)가. 때때로 쥐 빛 음식의 관계를 배울 수 5 개 이상 조절 세션을 필요로한다. </li></ol></li><li> 테스트 세션 (3 단계, 하나의 78 분 세션) : <ol><li> 혼자 청각 자극의 전달 구성 12 혼합 실험과 쥐를 제시. 집결지 간 시험 간격 포함분노 4.5 분 (범위 4.0 분 5.0) 각 청각 발표 후. </li><li> 시련의 6에서 10 초 동안 만 톤 자극 (미리 조정 자극)을 제시한다. </li><li> 다른 6 시험에서 10 초 동안 혼자 화이트 노이즈 (짝 자극)을 제시한다. </li></ol></li><li> 컨디셔닝 자극과 백색 잡음과 짝 자극과 톤을받을 쥐의 두 번째 세트와 연구를 완료하여 자극을 상쇄. </li></ol> 5. 약리 및 행동 절차 <ol><li> 행동 장치에 전원을 켜고 적절한 행동 세션의 MED-PC의 코드를로드합니다. 와이어 및 프로그램 행동 장치 소음 감쇄 캐비닛에 장착 된 팬은 전원이 켜져있을 때를 켜도록. </li><li> 클로자핀 N 옥사이드 (CNO)의 1 ㎎ / ㎖ 용액을 조제, 15ml의 원뿔형 튜브에 CNO 5.0 ㎎ 무게 멸균 0.9 % 멸균 SalI을 5 ml의 물 또는 5를 가하여NE. 솔루션까지 소용돌이는 분명하다. <ol><li> CNO는 용액에 용해되지 않는 경우 또는 CNO 더 농축 용액은 예컨대 DMSO (23), 용해 보조제를 추가 원하는 경우. 특히, 0.5 % DMSO와 CNO의 1 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 CNO 5.0 mg의 무게 15 ML 원뿔 튜브에 DMSO의 25 μl를 추가 할 수 있습니다. 톡 부드럽게 내용이 튜브의 바닥에 남아 보장한다. 맑은 용액이 될 때, 멸균 된 물을 5 ml 멸균 수 또는 0.9 % 식염수 5 mL를 추가한다. CNO의 솔루션을 준비하기위한 자세한 지침은 DREADD 위키 자원 25 페이지에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 이 관리되는 매일 새로운 CNO 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 1 mg을 투여 량으로 복강 내 주사를 CNO은 / 약 30 분 전에 행동 시험에 kg. 예를 들어, 1 ㎎ / ㎖ CNO 용액 0.2 mL를 200g 주입 쥐. CNO 관리의 투여 량과 시간 과정은 이전에 게시 된 보고서 2,12을 기준으로 선정되었다.<ol><li> (1 단계, 주사 4 일 총) 각 전처리 세션에 앞서 CNO 30 분을 주입하지만, 이후의 모든 행동 세션 이전에 차량을 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol></li><li> 30 분 후, 행동 시험 챔버로 쥐를 배치하고 적절한 행동 세션에 대한 컴퓨터 코드를 개시. </li><li> 행동 작업이 완료되면, 바로 챔버에서 래트를 제거한 동물 콜로니에 쥐를 반환한다. </li></ol> 행동 데이터의 분석 (6) 참고 : 모든 행동 세션의 종속 변수는 음식 컵에 적외선 광전지의 중단에 의해 검출 된 쥐의 머리가 음식 컵 안에있는 시간의 양입니다. (단위는 sec)의 데이터를 수집하여 컴퓨터 소프트웨어에 의해 기록된다. <ol><li> 조회하지 마십시오 전처리 단계에서 생성 된 데이터를 분석합니다. </li><li> 조절 세션의 각 쥐 &#39;를 분석부 합성은 5 행동 세션에서 시각적 자극의 프레젠테이션 중에 음식 컵 동작을 비교하여 빛 음식의 관계를 배울 수 있습니다. 특히, / 세션 (8) 시험의 각 5 초 광 시대 동안 음식 컵에 소요 된 평균 시간을 계산한다 (즉, 지속 시간 / 쥐의 각 5 초입니다 (8) 시험의 평균). 평균 제어 및 5 일 각 세션에 대한 실험 값을 (그림 3A 참조) 비교. <ol><li> 상기 5 초 광 에포크에 대해 지정된 것과 동일한 계산을 이용 5 행동 세션에서 음식 보상 (5 초 에폭)의 운반 중에 식품 컵 거동을 비교함으로써 음식 보상을 얻기 위해 쥐 &#39;동기를 분석한다. 이 값은 시각적 자극의 프레젠테이션 중에 획득 한 것보다 지속적으로 더 높을 것이다 (그림 3B 참조). </li></ol></li><li> 테스트 세션의 경우 : 대가에 응답 래트 &#39;음식 컵 동작을 설명 판정 비율을 계산할각각의 청각 자극의 entations. <ol><li> 특히, 각각의 쥐를 들어, 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요되는 평균 시간의 합으로 감각 컨디셔닝 자극의 6 프리젠 테이션 (즉, 톤)의 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 평균 시간을 분할 감각 컨디셔닝 자극 (즉, 톤 자극) 플러스 짝 자극 (즉, 백색 잡음 자극)의 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 총 시간의 평균. 각 시대는 지속 시간이 10 초입니다. 주 : 0.5 이상의 차별 점수가 쥐 감각 전처리 패러다임에 내재 된 연결을 배운 보여줍니다. </li></ol></li></ol> AAV 배치와 표현의 7. 확인 <ol><li> 마취로 transcardially 및 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 래트를 관류. 인해 형광 라벨의 사용 min으로 2 시간의 후 - 정착 시간을 초과하지imize 손실 항원의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. </li><li> 이일 최소 또는 뇌 뇌 병의 바닥에 가라까지 인산염 완충 식염수 (1X)의 20 % 자당 용액 30 ㎖를 함유하는 뇌 항아리로 전송하여 관류 뇌 탈수. </li><li> 관심 영역의 전체 rostrocaudal 범위에 걸쳐 관상 뇌 부분 (20 ~ 40 μm의)를 만들기 위해 동결 슬라이딩 마이크로톰을 사용합니다. </li><li> 디자이너 수용체 및 / 또는 기자 (12)의 위치와 발현을 확인하기 위해 태그 수용체 또는 리포터 단백질에 대한 면역 조직 화학 감독을 실시한다. 면역 조직 화학 염색 프로토콜은 DREADD 위키 리소스 페이지 (25)에 제공된다. </li><li> 수성 장착 매체의 100 ~ 200 μl를 사용 superfrost 플러스 슬라이드와 커버 슬립 위에 섹션을 탑재합니다. </li><li> AAV 배치 및 단백질 발현 12, 24을 확인하기 위해 뇌 조직에 형광 현미경을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li><li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine.">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li><li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> amnesia and the hippocampal system. , (1993).</li><li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network).">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+efferents+of+the+perirhinal,+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat.">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li><li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe:+implications+for+hippocampal+function.">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li><li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning.">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li><li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning.">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li><li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory:+retrograde+and+anterograde+findings.">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li><li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+preconditioning.">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning.">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules.">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li><li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-2+(AAV-2)+causes+trophoblast+dysfunction,+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia.">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li><li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+of+adeno-associated+virus+(AAV)+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples.">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma.">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+Pctk1,+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats:+impact+on+cognitive+function,+synaptic+plasticity+and.">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , (1996).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat:+a+neurophysiological+and+pathological.">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior.">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li><li>wiki, D. R. E. A. D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2014).</li><li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies.">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li><li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm.">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li><li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators.">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li><li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation.">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li><li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes.">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜은 특정 뇌 영역이 다단계 복잡한 학습 과제에 기여하는 방법을 조사하기 위해 약물 유전 학적 접근 (DREADD)를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 일시적으로 원격 학습 단계에 걸쳐 이산 뇌 영역에서의 신경 활성을 침묵하는 기능, 방법의 조합 학습의 미묘한 차이 또는 마스크 형태를 포함 행동의 넓은 범위를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 예에서, retrosplen...

행동 신경 과학 분야 내 흥분 도전 복잡한 행동 신경 기판을 결정하는 것이다. 그러한 고정 병변, 캐 뉼러를 통해 임시 임플란트 뇌 비활성화 및 optogenetics 같은 수많은 기술 복잡한 행동 부성분 이산 뇌 영역의 기여를 식별하기 위해 사용되어왔다. 이러한 접근 방식은 학습 기간 동안 지역 특이성에 대한 우리의 이해를 통보하면서, 각각의 기술은 한계가없는 것은 아니다. 특히, 영구적 병변은 일반적으로, 따라서 그 효과는 패러다임의 기간에 걸쳐 존재하는, 행동 시험 전에 실시하고 있습니다. 뇌 조직에 상당한 손상을 일으킬 수있는 단기 신경 inactivator (예를 들어, 테트로도톡신)의 프리젠 테이션을 포함하고 직전 행동 테스트에 대한 주체의 스트레스를 유도 할 수 삽관 연구. 또한, 삽관 통해 불 활성화를 둘러싼 조직의 영역에 한정되어캐 뉼러의 끝. optogenetics 특정 뇌 영역에서 활동의 시간적 제어를위한 유연성을 제공하면서 마지막으로, 그것은 비용 금지 및 기술적 요구하고있다. 이러한 제한은 약물 유전 학적 접근 (디자이너 - 수용체 - 전용 활성화별로 디자이너 - 마약, DREADDs) 1, 2를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 약물 유전학의 개념은 복잡하면서 중요한 것은, 상기 기술의 실행은 간단하다. 변형 억제 G 단백질 결합 수용체에 대한 DNA 단편을 포함 독소 (예, NMDA, ibotenic 산) 이산 뇌 영역으로는,이 기술은 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)를 주입하는 것을 포함의 주입을 포함하는 전통적인 정위 수술 방법과 유사하게 (hM4Di, 디자이너 수용체) 표준 실험실 설치류의 관심 영역으로는 (그림 1 참조). 바이러스 벡터는 형광 기자 (mcitrine)가 포함되어 있습니다. 에 통합되면세포에, 디자이너 수용체 (리포터 단백질) 최대한 ~ 삼주 후 주입을 표현하고 선택적으로 다른 생물학적으로 불활성 디자이너 약물의 전신 투여, 클로자핀-N- 옥사이드로 2-5 시간 동안 활성화 할 수 있습니다 (CNO) 1 , 3. 실험은 특정 뇌 영역에서 신경 활동을 정밀하게, 아직 원격 제어 시간을 부여하기 때문에, 약물 유전학은 여러 단계로 진행됩니다 행동 패러다임에 특히 잘 결합한다. 이 예에서, retrosplenial 피질의 기여 (RSC)은 자극 - 자극하는 학습이 파블로프 학습에서의 역할과 비교된다, 그러나 접근 방식의 조합은 뇌 영역에 기여하는 방법을 특정 식별을 추구 질문의 수에 적합하다 복잡한 행동. 본 프로토콜에 설명되지하면서 또한, 바이러스 및 형질 전환 방법은 세포 형 특이 DREADD 식 (2)를 달성하기 위해 사용될 수있다. 나는DREADD 접근 방식을 사용하는 경우의 고유 실험 조작, 실험 설계 및 후속 정량 분석​​의주의 깊은 고려의 약리학 및 / 또는 다른 유형을 포함하는 행동 패러다임이 필요합니다. DREADD 접근 방식에 새로운 실험자은 현재 DREADD 기술 2의 종합적인 검토라고합니다. 매일, 생물은 새로운 자극과 이벤트와 서로의 관계에 대해 알아 봅니다. 도 친숙한 환경에서, 이러한 가정으로, 하나는 이러한 변경의 의미있는 사건 예측 될 수 있기 때문에 자극 사이의 관계의 변화를 검출하기 위해 빠른 것이다. 이러한 자극 - 자극 (즉, 관계형) 학습은 여러 자극들이 결합되어 포함 전통적으로 내측 측두엽 4에서 중앙 상주하는 해마와 관련이있다. 그러나, 해마 존재도 단독으로 작용하지 않는다; 내부와 외부 모두 대뇌 피질의 영역내측 측두엽의 측면은 해마 형성 5-7에 중요한 감각 정보를 제공합니다. 전통 영구적 병변 연구는 해마에 의존하는 학습 대뇌 피질의 영역 (예를 들어,, retrosplenial postrhinal 및 entorhinal 피질)의 수의 참여에 대한 강력한 증거를 제공하지만 이산 단계에서 특정 지역의 역할을 식별 할 수있는 능력에 제한이 8-10 학습. 본 프로토콜은 RSC는 3 상 감각 전처리 패러다임 (11, 12)의 단일 단계에서 RSC를 침묵에 의해 자극 - 자극 학습에 필요한 가설을 테스트합니다. 간단히 말해서, 쥐 디자이너 수용체를 포함하고 2 ~ 3 주 후에 행동 테스트를 시작하기 전에 디자이너 약물 (CNO) 30 분 관리되는 AAV의 주입을받을 수 있습니다. 본 프로토콜에서는, 실험 쥐 시험의 첫 번째 단계 (자극 - 자극 리어 동안 CNO를받을닝 발생)하고는 시험의 다음 2 단계에서 차량을받을 수 있습니다. 행동에 CNO의 부주의 효과를 제어하기 위해, 디자이너 수용체 (hM4Di)와 쥐를 주입 대신 CNO의 차량에 주입. 바이러스 주입 및 수용체 발현의 일반적인 효과를 설명하기 위해, 설계자 수용체를 포함하고 CNO를 관리하지 않는 제어 바이러스 달이다. AAV의 상이한 혈청 형의 개수는 유전 물질을 전달하는 데 사용된다. 재조합 또는 합성 분자를 포함하는 연구 현재 NIH 지침 트랜스가 잠재적 종양 유전자 생성물 또는 독소 분자를 인코딩하지 않고의 부재하에 제조되는 것을 AAV (모든 혈청 형) 및 재조합 또는 합성 AAV 구조체를 유지 헬퍼 바이러스, BSL-1의주의 사항 (부록 B-1. 위험 그룹 1 (RG1) 에이전트) (13)을 필요로한다. AAV 구조, 유틸리티 및 안전에 관한 리뷰의 숫자는 14, 15 사용할 수 있습니다. 특히,하지만AAV 작업을 할 때, 설치류에서 가능한 생식 16, 17 및 잠재적 발암 메커니즘을 18 ~ 20에 관한 우려로 인해, 일부 기관은 BSL-2주의의 사용을 필요로한다. 연구는 질병 통제 및 미국의 유전자 조작에 바이러스 벡터를 사용하는 경우 재조합 DNA 분자 (13)를 포함하는 연구에 대한 NIH 가이드 라인, 센터를 실시한다 개별 기관의 감독위원회와 협의하여 사용하기 전에 해당 BSL을 확인합니다. 개인 보호, 연구자 훈련, 벡터 봉쇄, 오염 제거, 오염 제거 물질의 처분 및 사후 주입 동물 주택의 요구 사항은이 지침에 의해 지정됩니다. 또한, 상담 및 적절한 기관 동물 관리를 수행하고, 안전한 취급, 관리 및 AAV의 처분을 보장하기 위해위원회의 지침 또는 이와 동등한 기관 감독위원회 지침을 사용합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Male, Long Evans Rats, 55-60 d</td>
			<td >Hilltop Lab Animals Inc</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-GFP</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clozapine-N-Oxide</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >4936-10</td>
			<td>Designer Drug</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rat Cage lid (Polycarbonate)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FT 8XL-PC</td>
			<td>Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filer Paper (Replacement)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FP-R-1018XAD</td>
			<td>Filter paper that goes with cage lids</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table Top Vise</td>
			<td >JETS</td>
			<td >2201-265</td>
			<td>For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medline Biohazard liners&#160;</td>
			<td >Staples</td>
			<td >113444</td>
			<td>Biohazard Trash Bags</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle&#160;</td>
			<td >Amazon.com</td>
			<td ></td>
			<td>Biohazard Trash Can</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane, 100 mL</td>
			<td >Patterson Veterinary Supply Inc.&#160;</td>
			<td >07-890-8540</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 942</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 955</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Mask (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 906</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 1474</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microdrill burrs, 0.9 mm</td>
			<td >Fine Science Tools Inc</td>
			<td >19007-09</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Syringe pump with Micro4 Controller&#160;</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model UMP3-1</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit</td>
			<td >Ahdis</td>
			<td >21420</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine Skin Cleanser</td>
			<td >Perdue&#160; Products L.P</td>
			<td >67618-149-04</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triple Antiobiotic Ointment</td>
			<td >Medline Supply</td>
			<td >53329-087-01</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Vet Ointment</td>
			<td >Only Veterinary Supply</td>
			<td >17033-211-38</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite&#160;</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >AD7013MTL</td>
			<td>An alternative to the traditional disection scope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >MS36B</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >28 Gauge 10uL Syringe</td>
			<td >Hamilton&#160;</td>
			<td >80308-701SN</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-018MD</td>
			<td>22&#39;Wx22&#34;Hx16&#34;D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall Modular Test Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-007</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Grid Floor&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-005</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >House Light</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-215M</td>
			<td>Used as the house light and stimulus light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modular Pellet Dispenser&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-203M-45</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pellet Recetacle, Cup Type</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-200R1M</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head Entry Detector for Rat</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-254-CB</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dustless precision food pellets, 45 mg</td>
			<td >Bio-Serv</td>
			<td >F0165</td>
			<td >Behavioral supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cage Speaker for Rat Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-224AM</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable Audio Generator&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ANL-926</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smart Ctrl 8 Input/16 output Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-716P2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large Table Top Cabinet and Power Supply</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >SG-6510D</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCI Interface Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-700P2-R2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19&#34; Monitor</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >COM-103V</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (grannular), 1 kg</td>
			<td >Electron Microsopy Sciences</td>
			<td >19210</td>
			<td>Hazard:&#160; carcinogen, weigh in hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >3724S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >XP Rabbit monoclonal antibody (GFP)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >2956S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rabbit IgG</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >4412S</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td >VWR international</td>
			<td >483111-703</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for remotely silencing neural activity in rodents during discrete phases of learning

이 프로토콜은 동물이 학습과 기억 작업에 종사하는 동안 일시적으로 원격으로 분리 된 뇌 영역에서 신경 세포의 활동을 침묵하는 방법에 대해 설명합니다. 접근 방식은 결합 약물 유전학 (디자이너 - 수용체가-전용 활성화별로 디자이너 - 약) 행동 패러다임 (감각 컨디셔닝)와 학습의 다양한 형태를 구분하기 위해 설계되었습니다. 즉, 바이러스 - 매개 전달은 유전자 변형 억제 G 단백질 결합 수용체 설치류 뇌에서 분리 된 영역으로 (디자이너 수용체)를 표현하기 위해 사용된다. 디자이너 수용체 발현 수준이 높은 경우 3 주 후, 약물 제 (디자이너 약물) 사전 행동 특정 세션에 30 분을 전신적으로 투여된다. 약물은 디자이너 수용체 친 화성을 가지며, 따라서 디자이너 수용체를 발현 신​​경의 억제를 초래하지만, 그 생물학적으로 불활성이다. 뇌 영역 (2-5 시간 동안 침묵에 의존적 유지땡) 투여 량 및 투여 경로에. 행동 패러다임 종료 후 뇌 조직은 정확한 배치와 수용체 발현에 대해 평가된다. 이러한 접근 방법은 동작의 특정 구성 요소에 대한 각각의 뇌 영역의 기여를 결정하는 행동 패러다임의 번호에 걸쳐 사용할 수있는 특히 유용하다.

행동 결과 실험이 완료되면 특정 지역 임시 불 활성화 효과는 정량적 및 정 성적으로 평가되어야한다. 본 예에서는 CNO이 RSC 중립 자극 (12) 간의 연결의 형성에 필요한 가설을 테스트하기 위해 전처리 세션 동안 RSC에서 신경 활동을 감쇠 투여되는 3 상 행동 패러다임 (감각 전처리)를 포함한다. 중요한 것은, 실험자는 행동 패러다임 또는 약물 유전 학적 접근이 가장 행동...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning at JoVE.com

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

학습의 개별 단계에서 설치류에서 원격 음소거 신경 활동하는 방법

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

14.6K 조회수.  Oberlin College. This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

비디오: A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of humans with orofacial pain. To measure meal duration unrestrained rats are continuously kept in sound attenuated, computerized feeding modules for days to weeks to record feeding behavior. These sound-attenuated chambers are equipped with chow pellet dispensers. The dispenser has a pellet trough with a photobeam placed at the bottom of the trough and when a rodent removes a pellet from the feeder trough this beam is no longer blocked, signaling the computer to drop another pellet. The computer records the date and time when the pellets were taken from the trough and from this data the experimenter can calculate the meal parameters. When calculating meal parameters a meal was defined based on previous work and was set at 10 min (in other words when the animal does not eat for 10 min that would be the end of the animal&#39;s meal) also the minimum meal size was set at 3 pellets. The meal duration, meal number, food intake, meal size and inter-meal interval can then be calculated by the software for any time period that the operator desires. Of the feeding parameters that can be calculated meal duration has been shown to be a continuous noninvasive biological marker of orofacial nociception in male rats and mice and female rats. Meal duration measurements are quantitative, require no training or animal manipulation, require cortical participation, and do not compete with other experimentally induced behaviors. These factors distinguish this assay from other operant or reflex methods for recording orofacial nociception.

A lengthening in meal duration represents orofacial nociceptive behavior in rodents similar to the guarding behavior of humans with orofacial pain. Eating is a behavior that requires no training or animal manipulation, requires cortical participation, and is not competing with other experimentally induced behaviors, distinguishing this assay from alternative reflex or operant measurements.

설치류의 오로페이셜 모시피티브 응답의 척도로서의 식사 시간

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

연구

행동분석학

Automated Visual Cognitive Tasks for Recording Neural Activity Using a Floor Projection Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have developed visual cognitive tasks for rats using the Floor Projection Maze1,2&#160;that are optimized for visual abilities of rats permitting stronger comparisons of experimental findings with other species.
In order to investigate neural correlates of learning and memory, we have integrated electrophysiological recordings into fully automated cognitive tasks on the Floor Projection Maze1,2. Behavioral software interfaced with an animal tracking system allows monitoring of the animal's behavior with precise control of image presentation and reward contingencies for better trained animals. Integration with an in vivo electrophysiological recording system enables examination of behavioral correlates of neural activity at selected epochs of a given cognitive task.
We describe protocols for a model system that combines automated visual presentation of information to rodents and intracranial reward with electrophysiological approaches. Our model system offers a sophisticated set of tools as a framework for other cognitive tasks to better isolate and identify specific mechanisms contributing to particular cognitive processes.

We describe protocols for training rats for chronic electrophysiological recordings in fully automated cognitive tasks on a Floor Projection Maze.

바닥 투사 미로를 사용하여 녹음 신경 활동에 대한 자동화 된 시각인지 작업

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have ...

Measuring Neural and Behavioral Activity During Ongoing Computerized Social Interactions: An Examination of Event-Related Brain Potentials

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, an understanding of how perceptions of social exclusion develop over the course of a social interaction is important for advancing treatments aimed at lessening the harmful costs of being excluded. To date, most scientific examinations of social exclusion have looked at exclusion after a social interaction has been completed. While this has been very helpful in developing an understanding of what happens to a person following exclusion, it has not helped to clarify the moment-to-moment dynamics of the process of social exclusion. Accordingly, the current protocol was developed to obtain an improved understanding of social exclusion by examining the patterns of event-related brain activation that are present during social interactions. This protocol allows greater precision and sensitivity in detailing the social processes that lead people to feel as though they have been excluded from a social interaction. Importantly, the current protocol can be adapted to include research projects that vary the nature of exclusionary social interactions by altering how frequently participants are included, how long the periods of exclusion will last in each interaction, and when exclusion will take place during the social interactions. Further, the current protocol can be used to examine variables and constructs beyond those related to social exclusion. This capability to address a variety of applications across psychology by obtaining both neural and behavioral data during ongoing social interactions suggests the present protocol could be at the core of a developing area of scientific inquiry related to social interactions.

Research on social exclusion has grown tremendously in recent years. As the field expands, it is imperative to develop sophisticated methodologies allowing for the simultaneous measurement of neural and behavioral outcomes during social exclusion. This protocol utilizes event-related brain potentials to record ongoing neural activity during computerized social interactions.

지속적인 전산 사회적 상호 작용 동안 신경 및 행동 활성을 측정 이벤트 관련 뇌 전위 검사를

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, ...

The Double-H Maze: A Robust Behavioral Test for Learning and Memory in Rodents

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their behavioral flexibility and required memory duration, the number of goals and pathways, and also the overall task complexity. A confounding feature in many of these tasks is the lack of control over the strategy employed by the rodents to reach the goal, e.g., allocentric (declarative-like) or egocentric (procedural) based strategies. The double-H maze is a novel water-escape memory task that addresses this issue, by allowing the experimenter to direct the type of strategy learned during the training period. The double-H maze is a transparent device, which consists of a central alleyway with three arms protruding on both sides, along with an escape platform submerged at the extremity of one of these arms.
Rats can be trained using an allocentric strategy by alternating the start position in the maze in an unpredictable manner (see protocol 1; &#167;4.7), thus requiring them to learn the location of the platform based on the available allothetic cues. Alternatively, an egocentric learning strategy (protocol 2; &#167;4.8) can be employed by releasing the rats from the same position during each trial, until they learn the procedural pattern required to reach the goal. This task has been proven to allow for the formation of stable memory traces.
Memory can be probed following the training period in a misleading probe trial, in which the starting position for the rats alternates. Following an egocentric learning paradigm, rats typically resort to an allocentric-based strategy, but only when their initial view on the extra-maze cues differs markedly from their original position. This task is ideally suited to explore the effects of drugs/perturbations on allocentric/egocentric memory performance, as well as the interactions between these two memory systems.

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

더블 H 미로 : 설치류의 강력한 행동 학습에 대한 테스트 및 메모리

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their ...

Quantifying Learning in Young Infants: Tracking Leg Actions During a Discovery-learning Task

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning process. Here a method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process. This discovery-learning task uses an infant activated mobile that rotates and plays music based on specified leg action of infants. Supine infants activate the mobile by moving their feet vertically across a virtual threshold. This paradigm is unique in that as infants independently discover that their leg actions activate the mobile, the infants&#8217; leg movements are tracked using a motion capture system allowing for the quantification of the learning process. Specifically, learning is quantified in terms of the duration of mobile activation, the position variance of the end effectors (feet) that activate the mobile, changes in hip-knee coordination patterns, and changes in hip and knee muscle torque. This information describes infant exploration and exploitation at the interplay of person and environmental constraints that support task-specific action. Subsequent research using this method can investigate how specific impairments of different populations of infants at risk for movement disorders influence the discovery-learning process for task-specific action.

A method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process.

젊은 유아의 학습을 정량화 : 추적 다리 동작을 발견 학습 작업 중

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning ...

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for quantifying locomotor deficits in rodents is to measure minute disturbances of unconstrained gait overground (e.g., manual BBB score or automated CatWalk). However, cortical inputs are not required for the generation of basic locomotion produced by the spinal central pattern generator (CPG). Thus, unconstrained walking tasks test locomotor deficits due to motor cortical impairment only indirectly. In this study, we propose a novel, precise foot-placement locomotor task that evaluates cortical inputs to the spinal CPG. An instrumented peg-way was used to impose symmetrical and asymmetrical locomotor tasks mimicking lateralized movement deficits. We demonstrate that shifts from equidistant inter-stride lengths of 20% produce changes in the forelimb stance phase characteristics during locomotion with preferred stride length. Furthermore, we propose that the asymmetric walkway allows for measurements of behavioral outcomes produced by cortical control signals. These measures are relevant for the assessment of impairment after cortical damage.

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

비대칭 산책로 : 비대칭 로코 유학을위한 소설 행동 분석

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Using the Activity-based Anorexia Rodent Model to Study the Neurobiological Basis of Anorexia Nervosa

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A challenging illness to treat, due to the lack of understanding of the underlying neurobiology, AN has the highest mortality rate among psychiatric illnesses. To address this need, neuroscientists are using an animal model to study how neural circuits may contribute toward vulnerability to AN and may be affected by AN. Activity-based anorexia (ABA) is a bio-behavioral phenomenon described in rodents that models the key symptoms of anorexia nervosa. When rodents with free access to voluntary exercise on a running wheel experience food restriction, they become hyperactive &#8211; running more than animals with free access to food. Here, we describe the procedures by which ABA is induced in adolescent female C57BL/6 mice. On postnatal day 36 (P36), the animal is housed with access to voluntary exercise on a running wheel. After 4 days of acclimation to the running wheel, on P40, all food is removed from the cage. For the next 3 days, food is returned to the cage (allowing animals free food access) for 2 hr daily. After the fourth day of food restriction, free access to food is returned and the running wheel is removed from the cage to allow the animals to recover. Continuous multi-day analysis of running wheel activity shows that mice become hyperactive within 24 hr following the onset of food restriction. The mice run even during the limited time during which they have access to food. Additionally, the circadian pattern of wheel running becomes disrupted by the experience of food restriction. We have been able to correlate neurobiological changes with various aspects of the animals&#8217; wheel running behavior to implicate particular brain regions and neurochemical changes with resilience and vulnerability to food-restriction induced hyperactivity.

Here we present a protocol to induce activity-based anorexia (ABA) in female adolescent mice. ABA is a condition of hyperactivity evoked by imposing food restriction on rodents with access to a running wheel. This phenomenon is being used as a model to study the underlying neurobiology of anorexia nervosa.

활동 기반 식욕 부진 설치류 모델을 사용하면 거식증의 신경 생물학적 기초 연구에

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental paradigms and analysis tools have been limited to constrained laboratory tasks and contexts due to technical limitations imposed by the available set of measuring and analysis techniques and the age of the subjects. These limitations severely limit the study of developmental neural dynamics and associated neural networks engaged in cognition, perception and action in infants performing &#8220;in action and in context&#8221;. This protocol presents a novel approach to study infants and young children as they freely organize their own behavior, and its consequences in a complex, partly unpredictable and highly dynamic environment. The proposed methodology integrates synchronized high-density active scalp electroencephalography (EEG), inertial measurement units (IMUs), video recording and behavioral analysis to capture brain activity and movement non-invasively in freely-behaving infants. This setup allows for the study of neural network dynamics in the developing brain, in action and context, as these networks are recruited during goal-oriented, exploration and social interaction tasks.

This protocol presents a novel methodology for the neural decoding of intent from freely-behaving infants during unscripted social interaction with an actor. Neural activity is acquired using non-invasive high-density active scalp electroencephalography (EEG). Kinematic data is collected with inertial measurement units and supplemented with synchronized video recording.

인간의 유아를 자유롭게 행동의 사회적 상호 작용하는 동안 의도 모드의 신경 디코딩에 소설 실험 및 분석 접근

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in mice: the Feeding Experimentation Device (FED). FED is an open-source system that was designed to facilitate flexibility in food intake studies. Due to its compact and battery powered design, FED can be placed within standard home cages or other experimental equipment. Food intake measurements can also be synchronized with other equipment in real-time via FED's transistor-transistor logic (TTL) digital output, or in post-acquisition processing as FED timestamps every event with a real-time clock. When in use, a food pellet sits within FED's food well where it is monitored via an infrared beam. When the pellet is removed by the mouse, FED logs the timestamp onto its internal secure digital (SD) card and dispenses another pellet. FED can run for up to 5 days before it is necessary to charge the battery and refill the pellet hopper, minimizing human interference in data collection. Assembly of FED requires minimal engineering background, and off-the-shelf materials and electronics were prioritized in its construction. We also provide scripts for analysis of food intake and meal patterns. Finally, FED is open-source and all design and construction files are online, to facilitate modifications and improvements by other researchers.

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device (FED) is an open-source device for measuring food intake in mice. FED can also synchronize food intake measurements with other techniques via a real-time digital output. Here, we provide a step-by-step tutorial for the construction, validation, and usage of FED.

설치류에 음식 섭취를 측정하기위한 오픈 소스 장치의 건설 및 검증 : 실험 장치 (FED)를 먹이

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. Fundamental mechanisms that underlie this temporal control are widely studied using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism. In flies, the clock is typically studied by analyzing multiday locomotor recording. Such a recording shows a complex bimodal pattern with two peaks of activity: a morning peak that happens around dawn, and an evening peak that happens around dusk. These two peaks together form a waveform that is very different from sinusoidal oscillations observed in clock genes, suggesting that mechanisms in addition to the clock have profound effects in producing the observed patterns in behavioral data. Here we provide instructions on using a recently developed computational method that mathematically describes temporal patterns in fly activity. The method fits activity data with a model waveform that consists of four exponential terms and nine independent parameters that fully describe the shape and size of the morning and evening peaks of activity. The extracted parameters can help elucidate the kinetic mechanisms of substrates that underlie the commonly observed bimodal activity patterns in fly locomotor rhythms.

A method to quantify the main temporal features seen in fly circadian locomotor rhythms is presented. The quantification is achieved by fitting fly activity with a multi-parametric model waveform. The model parameters describe the shape and size of the morning and evening peaks of daily activity.