Name: direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. 바이러스 준비 및 전사 인자 조합 <ol><li> pSIN-EF1α 렌티 바이러스 발현 플라스미드 ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 및 LMO2 (표 1)에 대한 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 솔루션을 준비합니다. </li><li> 230 나노 미터, 260 나노 미터, 그리고 280 nm에서 분광 광도계 UV 흡수를 기록하여 렌티 바이러스 생산을 위해 사용 된 플라스미드 제제의 농도 및 순도를 측정한다. 참고 : 1.8보다 큰 DNA 준비 시연 A260 / 280과 A260 / 230의 값은 일반적으로 좋은 품질로 간주됩니다. 저급 A260 / 230 값이 염 또는 일부 용제와 같은 페놀 불순물을 표시하면서 하부 A260 / 280 값은 단백질 오염을 나타낼 수있다. 권장 플라스미드 농도는 1-3 μg의 / μL이다. </li><li> 이전에 발행 된 프로토콜 (11)에 설명 된대로 transductions에 대한 렌티 바이러스를 생성합니다. 팬 골수 잠재력을 가진 그는 유도는 ETV2 및 GATA1, 또는 ETV2 및 GATA2의 공동 발현을 필요로한다.적혈구와 거핵 세포 잠재력을 가진 그는 유도는 GATA2 및 TAL1을 필요로한다. LMO2 첨가 크게 GATA2 TAL1 및 (10)의 존재하에 hPSCs 에리스로 거핵 세포에서 세포의 수율을 향상시킨다. </li></ol> 2. hPSCs 문화 프로토콜 <ol><li> 계대 배양하기 전에 70~80%의 포화 상태에 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 만능 줄기 세포를 성장. 마크 제거는 자발적으로 세포를 계대 전에 식민지를 차별화. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 제조업체의 지침과 코트 6 웰 플레이트에 따라 상업 세포 외 기질 젤 (표 2 참조) 희석, 또는 사용하기 전에 37 ° C에서 한 시간 이상. 세포를 계대 전에, 매트릭스 대기음 신선한 완전 상용 culturemedium 2 ㎖를 추가 (표 2 참조)를 37 ℃에서 플레이트를 유지 ° C는 세포까지 5 % CO 2는 파종을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 통로 hPSCs <ol><li> ASPIRA(0.22 μm의 필터를 통해 여과하여 멸균 DMEM / F12 2 ㎎ / ㎖) 하나의 합류 hPSCs와 6 웰 플레이트의 잘 미리 예열 스파 아제 (Dispase) II 솔루션의 1.5 ml의 추가에서 테 매체. 콜로니의 에지면으로부터 들어 올려 시작할 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 5-7 분 동안 배양한다. </li><li> 기음 스파 아제 (Dispase) II 솔루션 조심스럽게 추가하고 신선한 DMEM / F12 배지 2 ㎖를 흡입에 의해 두 번 식민지를 씻는다. 다음에, 5 ㎖ 혈청 유리 피펫을 사용하여, 완전한 상용 신선한 배지 3 ㎖에 hPSCs 해리를 위아래로 수회 세포 현탁액으로 피펫 팅 (표 2 참조). </li><li> 각 웰 완전한 상용 배지 1.5 ml를 함유하는 6- 웰 플레이트에 세포 현탁액 0.5ml를 추가하기 (표 2 참조). 인큐베이터에 접시를 situating 때 균일 한 세포 분포를 확인하기 위해 앞뒤로 및 오른쪽에서 왼쪽으로 여러 번에 판을 선동. 37 ℃, 5 % CO 2 1을위한에서 세포를 유지8-24 시간. </li><li> 신선한 완전 상용 배지에 그 다음날 변화 매체 (표 2 참조) hPSCs 형태를 검토한다. hPSC 형태를 유지하는 작은, 잘 부착 식민지에서 성공적인 계대 결과. hPSCs 잘 매일 2.5-3 ml의 freshmedium 당으로 공급하고 70~80% 합류보다 더 이상 매일 4-5일를 계대해야합니다. 참고 : hiPSCs는 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에서 유지 된 경우, 그들은 공급 장치가없는 상태로 전송하고 효율적으로 차별화를 위해 전달하기 전에 2 ~ 3 회 계대 배양 할 필요가있다. </li></ol></li></ol> hPSCs (일 0, hPSCs의 형질 도입)에서 Hematoendothelial Pprecursors 3. 유도 <ol><li> 반응 매질 상업적 완전한 혈청 배지 1.3 ㎖의 결합 제조하려면, 바이러스, 폴리 브렌, 및 Y27632 ROCK 억제제 (표 1) (표 2 참조) : 최종 집중하고 1.3 ml의 배지에 10 밀리미터 ROCK 억제제 1.3 μL를 추가6 μg의 최종 농도 / ㎖ 내지 10 μM의 기, 및 폴리 브렌. <ol><li> 셀 당 각 바이러스의 0.5-1.0 방어의 최종 농도 (감염의 다중성)에서 바이러스 농축 (들)의 적절한 금액을 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 준비 될 때까지 얼음 상 또는 4 ℃에서 반응 매질을 유지한다. 참고 : GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1의 각 바이러스에 대한 방어의 동일한 금액 및 GATA2 / TAL1 / LMO2 반응 혼합물은 분화 유도에 최적입니다. ETV2에 대해 GATA2에 대한 방어를 두 배로 그러나 ETV2에 / GATA2 형질 문화, 차별화를 강화한다. 따라서 이러한 문화에 대한, 비율 1 : ETV2의 관성 모멘트와 GATA2 1 MOI 2 권장 (바이러스 농축이 약 6.8 × 10 7 입자 / ㎖ 추정되는 경우, ETV2 10 μL 및 GATA2 바이러스 농축의 20 μL를 추가 예를 들어, 6 웰 플레이트의 35mm의 잘 하나 ETV2 / GATA2 반응 당 0.68 × 10 6 세포). </li></ol></li><li> 단일 세포 SUSP에 hPSCs 준비ension. <ol><li> 하루 4 일 2 항에서 기술 한 마지막 구절 다음 공급 장치가없는 상태에서 hPSCs 성장 거꾸로 현미경으로 세포의 밀도와 형태를 관찰한다. hPSCs는 전달의 날 ~ 60~70%의 포화 상태없이 자발적 분화와 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 성장하고 도달해야한다. </li><li> 대기음 매체는, 웰 당 세포 해리 상업적 시약 (표 1) 1.5 mL를 추가하고 5-7 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 상업적 완전 배지 같은 부피로 세포를 수집하고 세포를 세고 생존력을 결정 ROCK 억제제의 10 μM과 (표 2 참조). 원심 분리에 의해 펠렛 세포 5 분 200 XG에 한 다음 ml의 당 3.4-5 × 10 6 세포의 농도로 ROCK 저해제의 10 μm의 상업 완전 배지에서 세포를 재현 탁. 참고 : 세포 생존에 성공 바이러스 전달 및 후속 차별화를위한 중요합니다.전형적으로, 전달 전에 세포 생존율이 90 %를 초과한다. </li></ol></li><li> 3.1에서 제조 한 반응 매질의 1.3 ml의 X10 0.68에서 1 사이에 106 세포를 함유하는 세포 현탁액 200 μl를 추가. </li><li> 2.2 제조 밤새 코팅 된 6- 웰 플레이트에서 매트릭스 용액을 대기음., 6 웰 플레이트의 한 웰에 반응 혼합물을 전송 및 분배를 균등 세포. 24 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 24 시간 후 세포의 적어도 80 %는 매트릭스에 부착되어야한다. </li></ol> hPSCs에서 Hematoendothelial 전구체 (4) 유도 (주 7) <ol><li> SCF 100ng의 / ㎖, TPO : 24 시간 후 형질 도입, 바이러스 - 함유 배지를 제거하고 상업적 불완전한 세포 배양 배지와 함께 첨부 된 세포를 세척 조혈 사이토킨 (표 1 참조), 그리고 상업용 불완전한 세포 배양 배지의 잘 함유 당 3 mL로 추가 50 ng를 / ㎖, bFGF를 (이하 3F 매체 라 함) 20 ng를 / ㎖. </li><li> 죽은 세포와 파편을 제거하는 일 2, 3, 4 일에 신선한 층 중간에 총 매체를 교체합니다. 부동 조혈 세포가 신흥 때 4 ml의에서 전체 볼륨을 유지하면서 4 일 후, 매일 3 층 매체의 절반을 교체합니다. 주 : pSIN EF1α-렌티 바이러스 발현 플라스미드시켜 형질 세포의 양성 선별을 허용 퓨로 마이신 내성 유전자를 통합. 퓨로 마이신의 1 μg의 / ㎖의 잔여 미분화 hPSCs을 제거 분화 제 1~2일 동안 배지에 첨가 할 수있다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 4 일에 세포 형태를 관찰 : 전형적인 내피 형태와 세포의 꽉 클러스터가 나타나기 시작 (도 2A, 3A). 일부 지역은 hPSCs 형태를 유지할 수있는 반면 라운드 혈액 세포는 분화 일 7 일 5에서 나타납니다. 아래에 설명 된대로 그와 조혈 차별화를 분석합니다. 참고 : 성공적인 hematoendothelial 다른iation 느슨하게 기본 평면에 부착 된 내피 세포와 같은 굴절 둥근 세포 나타나는 적혈구의 생산을 초래한다. 이 세포들은 적극적으로 분리 및 플로트 (도 2A 및 3A) 결국 작은 집합체를 형성 증식합니다. 라이브 혈액 세포는 광을 반사 및 배양 조건에서 확장 할 수있는 능력에 기초하여 죽은 세포와 죽어 시각적으로 구별 될 수있다. </li></ol> 5. 차별화의 Hemogenic 내피 (HE) 단계의 분석. <ol><li> 내피 형태와 세포의 현미경 관찰에 의해 일 3과 분화의 4 사이의 HE의 형성을 감지합니다. 차별화의이 단계에서 문화에 부동 혈액 세포가 없습니다. HE의 존재는 면역 형광 염색에 의해 확인 및 VE-cadherin의, CD73, CD226 및 CD43 항체를 사용하여 유세포 분석을 흐르게 할 수있다. <ol><li> 3 일에 유세포 분석을 사용 세포에 의해 그는 형성을 평가하기 위해한 실험에서 하루 4. 상업적 세포 해리 시약 배양 배양하여 세포를 수집하고 37 ℃에서 50-10 분 동안 (표 1 참조), 그 다음 5 % CO 2 및 염색 반응 당 1 × 105 개의 셀을 사용 (에 기재된 염색 절차 유동 세포 계측법 12). 참고 : 카데 린을 VE + 그는 세포는 초기 조혈 마커 CD226의 발현을 취득하지만, CD73 및 CD43 (6)의 표현이 부족하다. 대조적으로, 비 - HE 세포는 CD73 (도 2B, 3B)을 표현한다. </li></ol></li><li> hPSC 파생 HE에 대한 면역 형광 염색법. <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포의 부착 단층을 세척하고,이어서 실온에서 30 분 내지 60에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. </li><li> 세척 된 세포를 다시 PBS와 함께 실온에서 20 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100을 사용 Permeabilize 하시려면. </li><li> 세 번 PBS 두 세포를 세척 한 다음에 품어30~120 분간, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 PBS로 이루어진 차단 버퍼. </li><li> 일차 항체를 모두 포함하는 염색 액을 제조 (1 : 1000 희석) 마우스 항 - 인간 CD43의 토끼 항 - 인간 5 % FBS와 PBS에, (표 1)를 헤린 VE. </li><li> 세포로부터 블로킹 버퍼를 대기음 첨가 일차 항체로 염색 완충액 웰 당 1 ㎖의 추가; 실온에서 3 시간, 또는 밤새 4 ° C를 품어. </li><li> 5 % FBS와 PBS 2 ㎖를 첨가하여 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 1 차 항체를 포함, 두 번째 염색 버퍼를 준비 : 5 % FBS와 PBS 500 희석 : 당나귀 녹색 형광 염료, 및 적색 형광 염료 (표 1)과 결합 항 - 마우스가 결합 항 - 토끼를. 이차 염색 완충액 웰 당 1 ml에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 혈청없이 PBS로 3 회 세척 할 것. 300 nm의 DAPI는 DH에 솔루션을 작업하는 얼룩 세포10 ~ 15 분 동안 2 O. </li><li> PBS로 세포를 두 번 씻고에 잘 염색 된 세포와 PBS의 2-3 ml를 추가합니다. 녹색, 빨간색과 파란색 현미경 필터와 형광을 관찰한다. </li></ol></li></ol> 유도 조혈 전구 물질 6. 분석 <ol><li> 3.1에 ​​설명 된대로 떠있는 세포가, 3 층 중간의 절반을 변경, 10-14일까지 크게 확장 될 때까지 이틀, 차별화 문화를 유지한다. </li><li> 해리 및 상업용 세포 해리 시약으로 처리하여 세포를 세포의 단층을 구별 수집 37에서 50-10 분 동안 (표 1 참조) ° C, 5 % CO 2. </li><li> 문화 (12)의 조혈을 평가하기 위해 안티 - VE-cadherin의, CD43 및 CD45 항체를 사용하여 유동 세포 계측법을 수행합니다. 최대 ETV2 및 GATA2 형질 세포의 40 % 세포의 많은 부분이, 공동 표현은 VE-CAD 있고 CD43을합니다. 다음의 항체는 다음과 같은 예를 특정 세포 계통을 검출하는데 사용될 수있다xpansion 또는 유도 된 혈액 전구 세포의 분화 : CD235a (적혈구 세포), CD41a (거핵 세포), CD32 (골수 세포의 모든 유형), CD66b (호중구) 및 CD163 (대 식세포). </li><li> 제조업체의 지시에 따라 상용 클론 원성 배지 (표 1)을 사용하여 CFC-분석을 수행한다. <ol><li> 상업적 클론 원성 배지 3 ㎖에 1-2 × 104 세포를 전송 콜로니 형성 세포 및 조혈 콜로니의 종류의 수를 평가하기 (표 3 참조). 최적의 시딩 밀도는 서로 별개로의 성장과 겹치지 않는 단일 콜로니의 동정 및 분리 가능하다. 시드 밀도는 분화 효율에 따라 실험에 따라 다를 수 있지만, 상업 클론 원성 배지 1 ㎖ 당 1 × 104 세포를 초과하지 않아야합니다. </li><li> 부드러운 텍싱에 의해 상업 클론 원성 배지에서 세포를 혼합, 2 개의 35mm 매우 낮은 첨부 요리에 정지 3 ㎖를 전송CFC 분석, 각각의 접시에 서스펜션의 1.5 ml를합니다. 균등 매체를 배포하고 14 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어. 요리를 방해하지 마십시오; 7 일 및 분석의 날 (10)에 콜로니 형성을 관찰합니다. </li><li> 14 일에 자신의 형태학에 따라 조혈 식민지를 확인하고 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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TF가의 과발현 hPSCs의 조혈 분화 상기 방법은 인간 배아 줄기 세포 및 이에 최대 30 수백만 혈액 세포의 생산에서 허용 iPSCs로부터 HE 및 골수와 erytho-magakaryocytic 전구 세포의 생성을위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다 백만 만능 줄기 세포 (10). 이 방법은 다수의 hESC iPSCs 및 라인 (10)에 일관된 분화를 나타내었다. ETV2 및 GATA2로 분화하는 동안, GATA1 요인뿐만 아니라 GATA2 및 TAL1 요인,...

자기 갱신과 혈액을 포함한 세 가지 배엽의 세포로 분화하는 조혈 개발의 역학적 연구에 그들에게 가치있는 도구를 만들어, 혈액 질환의 모델링, 약물 검사에 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 독특한 능력, 독성 연구 및 세포 요법의 개발. 내피 조혈 전환 1, 2를 통해 (HE) hemogenic 내피 세포에서 배아 진행 혈액 형성, 문화 HE의 발생 조혈 전환 및 조혈 사양 내피 조절 분자 메커니즘을 연구하는 것이 필수적 것 때문에. 그는 연구에 대한 현재의 방법은 조혈-지지 기질 세포 6,7 또는 세포 외 두 개의 차원 문화 hPSCs의 조혈 사이토 카인 3-5의 추가와 골재 (사채)에서 hematoendothelial 분화 유도 및 공 배양을 기반으로 행렬과 C8,9 ytokines. 이러한 고전 분화 방법은 세포 표면에서 작용하는 결국 hematoendothelial 개발을 유도 전사 프로그램의 활성화로 이어질 분자 경로 캐스케이드를 개시하는 외부 신호의 도입에 기초한다. 따라서, 이러한 시스템에서의 분화 hPSCs의 효율은 그 신호의 효과적인 유도 핵 신호 전달 및 특정 전사 레귤레이터 얻어진 활성화에 의존한다. 또한, 기존의 분화 배양 년의 연구는 세포 정렬을 사용하여 HE에게 세포를 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 조혈 전사 인자의 과발현에 의해 그와 혈액의 직접 유도를위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 복잡 셀 정렬 절차를 사용하여 HE의 분리를위한 필요없이 요리와 조혈 전환에 내피의 직접 관찰 년의 효율적인 유도 할 수 있습니다. 인간 만능 줄기 세포에서 HE의 형성과 혈액을 효율적으로 몇 전사 인자 (TFS)를 과발현에 의해 유도 될 수있다. hPSCs에서 강력한 팬 골수 조혈을 유도 할 수있는과 TF의 최적 조합은 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2을 포함한다. 대조적으로, GATA2 및 TAL1의 조합 erythromegakaryocytopoiesis 10을 유도한다. CD73 - - 점차적으로 초기 조혈 마커 CD43 (7)의 발현에 의해 정의 된 조혈 표현형을 획득 그는 세포 이러한 요소의 과발현을 통해 hPSCs를 프로그래밍 직접에 hPSCs가 VE-CAD + CD43을 구별합니다. 인간 다 능성 줄기 세포에있어서의 직접 프로그래밍이 렌티 기반 방법은 역학적 연구 조혈 전이 내피에 대한 연구, 개발 및 조혈 및 명세서의 전사 조절을위한 HE 및 혈액 세포의 생성에 적용 할 수있다. C 있지만urrent 프로토콜은 유사한 결과가 수정 10의 mRNA를 사용하여 얻을 수 있었다 유전자의 구성 적 발현을 이용한 혈액 생산을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 1.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>A11105-01</td><td>Cell Dissociation Reagent</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 Custom formulation&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!D12&quot;&gt;Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Premium grade</td></tr><tr><td>human TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Research grade</td></tr><tr><td>human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Premium grade</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead assay (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Cell fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&amp;nbsp;</td><td>Permeabilization&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&amp;nbsp;</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>DAPI nucleic acid stain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>D1306&amp;nbsp;</td><td>Live/Dead assay (IF)</td></tr><tr><td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-assay</td></tr><tr><td>Wright Stain solution</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Staining cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 2.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;hPSCs culture.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td><td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td></tr><tr><td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 media&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>M500&amp;nbsp;</td><td>Serum-free&amp;nbsp; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&amp;nbsp;</td><td>356234</td><td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, powder&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>12500-062</td><td>Basal Medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco&#039;s PBS powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>17105-041</td><td>Neutral protease, Cell dissociation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 3.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;Primers for detection of virus genomic integration.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primer&#039;s Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Forward (Fwd)&amp;nbsp; 5&amp;rsquo; --&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Reverse (Rev) 5&amp;rsquo;--&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Discription&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a promoter sequence</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

개발하는 동안, 조혈 세포가 혈관 내피 세포의 전문 집합에서 발생, hemogenic 내피 (HE). 체외에서 모델링 HE 개발은 내피 - 조혈 전환 및 조혈 사양의 기계 론적 연구에 필수적이다. 여기서, 우리는 전사 인자의 다른 세트의 과발현로서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 HE의 효율적인 유도하는 방법을 설명한다. GATA2 TAL1 및 전사 인자의 결합은 적혈구 및 거핵 세포 가능성 HE의 생성을 허용하면서 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2과 TF들의 조합은 팬 - 골수 가능성 HE를 유도하기 위해 사용된다. GATA2 및 TAL1 조합에 LMO2의 추가는 실질적으로 차별화를 가속화하고 적혈구와 거핵 세포 세포의 생산을 증가시킨다. 이 방법에서 hPSCs HE 유도 효율적이고 빠른 방법을 제공하고 내피 hematopoieti의 관찰을 허용배양 접시에서 C 전환. 이 프로토콜은 hPSCs 전달 절차 및 HE의 후 전달 분석 및 혈액 전구 세포를 포함한다.

GATA2가, TAL1는 +/- LMO2 조합은 주로 에리스로 거핵 세포 조혈을 유도하면서 그와 전사 인자의 과발현에 의해 hPSCs에서 혈액 유도의 개략도는 팬 골수 조혈을 유도 GATA1 또는 GATA2 조합 그림 1. ETV2에 표시됩니다. 두 TF 조합 직접적이어서 조혈 분화 구별 스펙트럼 혈액 선조로 변환 HE 세포를 유도. 혈액 만능 상태에서 hPSCs의 차별화 그는 평균 사일 취 생산. 둥근 혈액 세포의 분화는 제 5 일?...

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Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

생물학

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...