The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

모든 마우스 처리 및 처리 절차는 로컬 동물 관리위원회에 의해 의회 및 / 또는 동물 보호 프로그램에 의해 규정 승인 규칙을 준수해야합니다. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 로컬 동물 관리위원회의 승인을 동물 관리에 캐나다위원회의 지침에 따라 수행되었다. 주의 : 방사능 모든 작업은 (포함하지만 방사성 동물 조직, 침구 폐기물 처리, 삼중 수소 처리, 외부 γ-조사에 국한되지 않음) 입법부 및 / 또는 방사선 방호 당국이 정한 규칙을 준수해야하며, 권한을 수행 할 공인 된 실험실 및 / 또는 시설에서 직원. 1. 동물 일 <ol><li> 동물 그룹화 <ol><li> 마우스 조직 외부로부터 도착하는 경우, 동물 시설에서 적어도 10 일 동안 동물들을 순응. 연구는 여러 치료 그룹을 포함하는 경우, 동물 공급자가 알을 보낼 수 있도록하나의 배치로 L 동물. </li><li> 무작위 그룹 당 10 쥐의 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. C57BL / 6 변형의 수컷 마우스를 사용하는 경우, 침략 문제를 완화하기 위해 자신의 시설에 매우 젊은 C57BL / 6 남성의 무작위를 미리 준비 동물 공급 업체가 있습니다. </li></ol></li><li> 내부 β-방사선에 쥐의 만성 노출 <ol><li> HTO와 OBT 솔루션 (삼중 프롤린, 알라닌과 글리신 아미노산의 혼합물)의 원래 주식을 희석하여 마우스 마시는 물에서 작업 삼중 수소의 농도 (10 kBq / L과 1 MBq의 / L)를 준비합니다. </li><li> 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하여 마시는 물에 삼중 수소의 최종 농도를 확인합니다. 필요한 경우, 농도를 조정합니다. </li><li> 삼중 수소 물에 액세스 임의로를 제공하여 1 개월 동물을 취급합니다. 처리 물이 2 주 기간 동안 낮은 들어갔을 경우, 더 많은 물을 추가 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 2 주에서 병을 변경합니다. </li><li> 취급 가짜 조사 제어쥐 동일. 별도의 &quot;깨끗한&quot;방에서 또는 공중에서 삼중 수소 교차 오염을 방지하기 긍정적 인 공기 압력 아래에 별도의 &quot;깨끗한&quot;선반에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 외부 γ - 방사선에 쥐의 만성 노출 참고 : γ-조사 시설 / 장비 위치에 따라 달라집니다. </li><li> 선량의 가능한 방법을 사용하여 원하는 선량률 제조 방사선 필드가 γ-방사원으로부터의 거리를 결정한다. 동물 케이지를 덮고있는 지역 내 방사선 분야의 동질성을 확인합니다. 참고 : 1.7 μGy / h는 1 MBq의 / 몸에 L 삼중 수소에 의해 생성 된 선량률에 해당합니다. </li><li> 1 개월 단계 1.3.1에서 결정된 거리에서 마우스 케이지를 배치하여 쥐를 노출. 30 분에 γ-조사의 일상 중단을 최소화합니다. 총 흡수 선량을 측정하는 thermoluminescence의 선량계를 사용합니다. </li></ol> 2. 희생과 샘플링 <oL&gt; <li> 삽입 70 마이크론 셀 스트레이너, 15 ml의 1.5 ㎖의 튜브 멸균 수술 도구, 60mm 페트리 접시를 준비 모든 생물학적 안전 캐비넷 내에 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 장소 보충 RPMI 매체. 작품의 불임을 보장하는 것은 매우 중요하다. </li><li> 각 60mm 페트리 접시에 RPMI 배지 5 ㎖를 분배. </li><li> 지역 동물 보호위원회의 승인 방법을 사용하여 마우스를 희생. 경추 탈구는이 프로토콜에 설명 된 비장의 작업을위한 좋은 선택이 될 것입니다. (mFISH, 사이토 블록 소핵 또는 다른 일반적인 genetoxicity 분석에 대한 예를 들어,) 다른 분석을위한 혈액 샘플이 필요한 경우, 이소 플루 란으로 마취 후 내 심장 천자를 사용합니다. </li><li> 머리는 멀리 가리키는, 지느러미 드러 누움에서 동물을 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스를 분무. 집게를 사용하여 요도 개구부에 전방으로 피부를 잡아 회음부에 가위로 작은 절개를합니다. <oL&gt; <li> 이 절개에서, 단지 아래의 근육 벽을 피부를 잘라하지에주의하면서 흉강으로 복부 정중선을 따라 절단. 거리 중앙선으로부터 피부를 해부. </li><li> 집게로 복부 벽을 잡고 복강을 열어 근육 벽의 중앙 축을 따라 잘라. </li></ol></li><li> 가볍게 동시에 가위로 결합 조직을 잘라내는 동안 당겨 부드럽게 멸균 집게와 함께 파지하여 비장을 절제. </li><li> 1.5 ML 튜브에 비장 (비장의 약 1/10)과 장소의 작은 조각을 잘라. 스냅 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 다음 저장을 위해 액체 질소에 동결. </li><li> 사전 분배 RPMI 미디어의 5 mL를 60mm 페트리 접시 안에 셀 스트레이너에 비장의 나머지를 놓습니다. </li><li> 다음 마우스로 진행합니다. 참고 : 추출 된 비장은 매체와 60mm 요리에 보관 될 수있는 마우스의 나머지 sacrific 동안 (최대 2 시간 동안)에디션. 도 5 및 15 생쥐 간, 참가 인원수에 따라 하루에 처리 될 수있다. </li></ol> 비장 세포 배양 3. 준비 <ol><li> 곡선 끝 멸균 집게로 셀 스트레이너 내부 닦지하여 비장 균질화. </li><li> 셀 스트레이너를 제거하고 15 ML 튜브에 60mm 접시에서 필터링 된 세포 현탁액을 수집합니다. </li><li> 셀들의 나머지를 수집하기 위해 미디어의 5 ml의 셀 스트레이너 린스. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. </li><li> 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 10ml에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. </li><li> 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 5 ml의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 25 ㎖의 조직 배양 플라스크에 넣고 세포 현탁액 4 ㎖에 및 CO 2 인큐베이터에 제거 (37 ° C, 5 % CO 2, 80 % 습도) </li></ol> 4. 조사 도전 고정 <ol><li> 이동4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 얼음과 원심 분리기에 1.5 ML 튜브로 단계 3.8에서 세포 현탁액 1 ml의 나머지. 이 샘플에서 측정 된 DNA 손상은 DNA 복구 곡선의 건설을위한 모두 치료에 의한 손상 및 T = 0 데이터 포인트를 나타냅니다. </li><li> 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 완충액 (20 mM 트리스 pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을) 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS의 300 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 낮은 속도로 소용돌이에 혼합하는 동안, -20 ° C 100 % 에탄올 700 μL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 혼합 몇 번 반전. </li><li> -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 에탄올 고정 된 비장 세포 γH2AX 신호에 띄는 손실없이 최소 12 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 도전 γ-RAD와 단계 3.8에서 비장의 문화를 조사<html> 가능한 조사 장치를 이용 선량률 ≥ 200 mGy의 / 분의 2 Gy의 iation 도즈. 참고 :이 조사의 목적은 수리 기계에 도전하는 DNA DSB을 유도하는 것입니다. X 선은 또한이 목적을 위해 사용될 수있다. </li><li> 즉시 CO 2 배양기에 문화를 반환합니다. </li><li> 1 시간 도전 2 Gy를 조사 후, 생물 안전 캐비닛에 인큐베이터에서 문화를 제거합니다. 대표 샘플 나누어지는를 수집하려면, 부드럽게 얼음에 1.5 ML 튜브에 피펫과 세포 현탁액의 전송 1 ml의를 사용하여 세포를 다시 일시 중지합니다. CO 2 배양기에 세포 배양을 돌려줍니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 반복 4.3 단계 - 4.5. </li><li> 24 시간 도전 2 Gy의의 γ-조사, 수확 후 단계 4.8에 설명 된대로 24 시간 샘플 =에 수정 - 4.10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. 안티 γH2AX 항체와 면역 형광 라벨링 참고 : 일반적으로 15 - 하루에 30 샘플 immunofluorescently 표시된 단일 실행에 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 처리 군 간의 정확한 비교를 보장하기 위해, 각 그룹의 샘플 (S)을 포함한다. 또한 자세한 내용은 (16)을 참조하십시오. <ol><li> 얼음에 표시된 샘플 수에 대한 튜브 세트를 처리 할 장소를 준비합니다. 12 X 75mm 상한선 유리 튜브를 사용합니다. 불임은이 일을 위해 필요하지 않습니다. ( &quot;2 Ab의 전용&quot;) 만 차 항체와 라벨링에 대한 하나의 추가 역사적 제어 샘플을 포함합니다. 연구 내에서 실행 세포 계측법 모든 흐름이 역사적 제어 샘플을 사용합니다. </li><li> 각각의 튜브에 얼음처럼 차가운 TBS의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 5 초 동안 -20 ℃, 소용돌이에서 고정 된 비장 세포를 제거하고 TBS로 준비 튜브에 0.5 ml의 나누어지는을 전송합니다. -20 ° C 저장에 다시 샘플의 나머지를 놓고백업 샘플로 유지한다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 비장 세포. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 1 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시 </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. TST 완충액 (TBS의 0.05 % 트리톤 X-100, 2 % FBS)의 1 ml의 펠릿을 다시 일시 부드럽게 상등액을 가만히 따르다. 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 1 차 희석 방지 γH2AX 항체 200 μL에 펠렛을 다시 일시 : TST 버퍼 (150). &quot;2 Ab의 전용&quot;제어 샘플 TST 200 μl를 사용합니다. </li><li> (45)의 각도로 회전하는 통에 위치 튜브 - 60 °와 실온에서 300 XG에 1.5 시간 동안 흔들어. </li><li> TST 버퍼 200 희석 튜브 배양하는 동안 1 알렉사 488로 접합 된 염소 항 - 마우스 이차 항체의 충분한 용적 (200 μL / 시료)을 제조 하였다. 참고 : 알렉사-488를 포함한 모든 작업을복합 항체 (5.10 이하 5.16 단계를) 어두운 조명 조건에서 수행해야하며, 표시된 샘플은 알루미늄 호일에 튜브를 포장하여 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 1.5 시간 인큐베이션이 완료되면, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG 각 원심 관에 2 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖를 추가한다. 2 % FBS가 포함 된 TBS의 1 ml의 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 단계 5.8에서 차 항체 용액 200 μL에 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 단계 5.7에서와 같이 1 시간 동안 진탕 플랫폼에서 샘플을 품어. </li><li> 1 % FBS를 포함하는 얼음처럼 차가운 TBS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 50 μg의 / ㎖를 포함하는 TBS의 0.5 ml의 펠렛을 다시 중단요오드화 프로피 듐. </li><li> 빛으로부터 보호 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 악기 고유의 프로토콜 16을 사용하여 흐름 cytometer에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 샘플 당 최소 10,000 세포를 읽어보십시오. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

이 논문에 제시된 프로토콜은 전리 방사선 등 다양한 화학적, 물리적 에이전트의 낮은 수준의 유전 독성 효과를 조사 생체 내 연구에 대규모 마우스를 수행하는 데 유용합니다. 우리 고유의 무균 동물 시설은 GammaBeam 150 조사 장치를 장착하고 30 미터 길이의 조사 홀은 수백 또는 마우스의 수천에 낮거나 매우 낮은 선량률 조사되어 관련된 평생 연구를 수행 할 수 있습니다. 만성 저용량 조사...

(매스 미디어에 의해 악화) 방사선 히로시마와 나가사키 원자 폭탄의 희귀 원자력 발전소 사고의 이미지에 의해 구동 방사선 대중의 공포를, 이온화​​ 낮거나 매우 낮은 용량 중 하나의 잠재적 인 해로운 영향에 비해 상당한 논쟁에 주도하고있다 매우 엄격한 방사선 방호 규제와 잠재적으로 과학적으로 정당하지 않은 기준. 지난 30 년에, 다수의 보고서는 유해의 부족과 낮은 선량 방사선 1-4에 의한 잠재적으로 유익한 생물 효과의 존재를 모두 기록했다. 주요 방사선 건강 위험 요인은 방사선의 높은 또는 중간 용량을 수신 원자 폭탄 생존자의 역학 연구에 기초하여 추정 암의 확률이다. (그래서 선형 노 임계 값 또는 LNT 모델 호출되지) 이러한 데이터의 선형 외삽은 낮은 용량에서 암의 위험을 추정하는 데 사용됩니다. 그러나,이 접근법은 세계적 과학 수용을받지 못한무겁게 5를 논의한다. 그것은 더 연구가이 문제를 명확히하고 아마도 방사선 보호 기준을 개선하는 데 필요한 것이 명백하다. 이러한 연구는 DNA 손상 비율, DNA 수리 및 돌연변이 유발 등과 같은 엔드 포인트 (인간에 효과를 외삽을 위해 최선을) 생체 내 동물 모델에서 만성 치료 (환경 적, 직업적 노출의 가장 근사치)를 포함한다. 그것은 DNA가 돌연변이와 암 개발 (6)으로 이어질 수 방사선 효과와 불완전하거나 잘못된 수리 손상의 기본 목표 것으로 알려져있다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 DNA 병변의 가장 해로운 유형 중 하나이며, 세포 사멸 및 종양 7 발생할 수 있습니다. 이는, 따라서, 중요한 확실하고 정확하게 저용량 방사선 및 / 또는 화학 물질과 같은 다른 오염물 스트레스에 노출 된 후 DSB의 수준을 측정 할 수 있어야한다. 가장 민감하고 특이 마커의 한DNA DSB의 γH2AX 8라는 인산화 히스톤 H2AX이며, 또 다른 마커 및 방법은 9,10 제안되었다. 그것은 H2AX 분자 수천, 유도 DSB의 근방에, 안티 γH2AX 항체 및 형광 현미경 (11)에 의한 면역 형광 라벨링 개별 DSB의 검출을 가능 γH2AX의 형성에 관여하는 것으로 추정된다. 반응은 최소 30 내지 60의 최대 도달 매우 빠르다. 증거 γH2AX 나누기의 사이트에 다른 수리 요소를 유치 및 깨진 DNA의 끝을 고정하고 (12에서 검토) 다른 수리 단백질에 대한 액세스를 제공하기 위해 크로 마틴 구조를 수정하여 DNA DSB의 수리를 용이하게하는 것이 존재한다. DNA DSB의 수리가 완료되면, γH2AX은 인산화 해제 및 / 또는 저하를 거쳐, 새로 합성 H2AX 분자는 크로 마틴 (10)의 영향을받는 지역에 γH2AX 교체됩니다. γH2AX의 형성과 손실을 모니터링 할 수 있습니다,따라서, DNA 복구 DSB 동력학의 정확한 추정치를 제공한다. 이 방법은 방사선 감수성 13-15과 상관하는 것으로 나타났다 방사선 및 그 잔류 율 및 DSB 레벨 고용량 조사 다양한 인간 종양 세포주에서 DSB 수리를 연구하기 위해 사용되었다. 우리는이 실험적인 접근 방식을 수정 DNA DSB 수준 및 수리 (그림 1)에 만성 γ-와 β-조사의 낮은 용량의 영향을 조사하기위한 생체 내 마우스 연구에 적용했다. 첫째, 우리는 마시는 물에 용해 β-방사선 삼중 물 (HTO)의 형태로 하나의 삼중 수소에 의해 방출 (수소 3) 또는 유기적으로 결합 된 삼중 수소 (OBT) 마우스의 장기 만성 노출을 수행하는 방법을 보여 . 두 형태의 축적 및 / 또는 다른 신체에 따라서 분배, 상이한 생물학적 효과를 생성 할 것으로 예상된다. 두 형태의 원자력 산업에 잠재적 인 위험이 있습니다. 이 치료상대적인 생물학적 효능의 평가를 위해 중요하다 방사선 두 종류의 정확한 비교를 할 수 있도록 상응하는 투여 율 γ-만성 방사선에 노출 병행된다. 베타 방사선 γ 방사선, 고 에너지 광자에서 매우 상이한하게 전자 구성된다. 이 때문에 차이로 Β-방사선은 주로 내부 건강 위험을 나타내며, γ-방사선을 비교하여 서로 다른 생물학적 효과를 생성 할 수있다. 이 합병증은 β-방사선에 HTO에 의해 방출을 노출의 규제에 비해 상당한 논쟁의 결과. 따라서, 공공 식수에 HTO의 규제 수준은 유럽에서 100 BQ / L에서 호주에서 75,000 BQ / L로 변화한다. 또한 γ-방사선의 선량 당량 HTO의 생물학적 효과를 비교하는 것이 중요하다. 둘째, DNA DSB의 속도는 immunofluorescently 감지 γH2AX 표시하여 만성 노출의 완료에 고립 된 비장 세포에서 측정유동 세포 계측법에 의해 에드. 이는 생체 내 노출에 의해 가해진 DNA 손상의 정도를 평가할 수있다. 그러나, 이러한 낮은 수준의 노출이 DNA 중 어느 DSB 검출 속도를 얻지 못할 수 있다는 기대 분별이고; 대신, 숨겨진 변경 / 응답은 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력에 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다. 이러한 변화는, 발견하는 경우가 될 수도 있고 자극 (해로운 효과를 생산) (유익한 효과를 생산) 또는 억제. 제안 된 프로토콜은 손상의 상당한 양의 생산 방사선의 고용량으로 추출 비장 도전하여 그러한 변경을 드러내는 허용 (예를 들어, 2 Gy의 약 50 셀당 DNA DSB 또는 3의 제조 -. 총 γH2AX 레벨의 5 배 증가) . 그 후, DSB 수리의 시작과 완료를 반영 형성과 γH2AX의 손실, 유동 세포 계측법에 의해 감시된다. 이러한 방식으로, 기저 및 DNA DSB의 치료 - 유도 수준뿐만 아니라 측정 될 수 있지만,또한 세포의 기능에 미치는 잠재적 인 효과가 응답하고 수리 DNA 손상이 훨씬 더 높은 스트레스 수준에 의해 유도.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

저용량 방사선 노출은 높은 방사선 량에 의해 생성 효과에서 수량과 품질이 상이한 생물학적 효과의 다양성을 생성 할 수있다. 적절한 과학적으로 정당화 방식으로, 환경 산업 및 공중 보건 안전과 관련된 질문을 해결하는 것은 크게 정확하게 방사선 및 화학 물질을 이온화 낮은 복용량 오염 물질의 생물학적 효과를 측정 할 수있는 능력에 의존한다. DNA 손상 및 수리로 인해 암과 같은 잠재적 인 장기 결과에 건강 위험의 가장 중요한 초기 지표입니다. 여기에서 우리는 마우스의 비장 세포에서 DNA 손상 수리 및 γ-와 β-방사선의 낮은 복용량에 생체 노출 만성의 효과를 연구 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. DNA 이중 가닥 나누기 일반적으로 받아 들여지는 마커를 사용하여, γH2AX라는 인산화 히스톤 H2AX, 우리는 DNA 손상뿐만 아니라 레벨을 평가하는 데 사용될 수있는 방법을 설명하지만,도 변화DNA 복구 능력에 잠재적으로 생체 내 노출의 저용량에 의해 생산. 많은 수의 샘플에 표지 immunofluorescently γH2AX의 빠르고 정확하고 신뢰성있게 측정 계측법 흐른다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리는 (DNA 수리를 트리거 쉬는 충분한 수를 생성하기 위해 2 Gy의의 도전 량 추출 비장 세포를 노출시킴으로써 및 유도 (1 시간 조사 후) 잔류 DNA 손상을 측정함으로써, 24 시간을 평가할 수있다 사후 조사). 잔류 DNA 손상은 불완전한 복구 및 장기 게놈 불안정성과 암의 위험을 나타내는 것이다. 용이하게 생체 내 연구 (예를 들면, 염색체 수차 골수 망상 적혈구의 소핵 주파수, 유전자 발현, 등) 등으로 측정 할 수있는 다른 분석 및 종점과 결합하여,이 방법은 생물학적 효과의 정확한 상황 평가할 수있다 낮은 수준의 스트레스.

비장 예상 그래프 여기서 설명한 방법을 이용하여 제조 계측법도 2는 플로우의 예를 나타낸다. 세포가 처음 &lt;전자 볼륨 측 분산&gt; 산점도를 기반으로 문이된다 (그림 2A 및 2D, 전자 볼륨 앞으로 분산에 해당). FL3 / 프로피 디움 요오드 히스토그램 (도 2B 및 2E)는 정상 세포주기 분포를 확인한다. FL1 채널을 이용하여 계산 γH2AX 신호를 ...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K 조회수.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

연구

생물학

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</emDNA 손상 복구에 참여&gt;, 9 유전자

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

높은 재현성과 단순 명료 한 방법이 수행하는<em&gt; 생체</em눈 개봉 후 마우스에서&gt; 안구 탈핵

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.