우리는이 원고에서 그래픽 디자인 및 사진 데이비드 R. 리 게스, MA에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 UTHSCSA 유동 세포 계측법 핵심 시설 UTHSCSA 고급 핵산 핵심 시설에 GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA054174)에서 자금에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

본 명세서에 기재된 생체 내 돌연변이 유발 분석은 원래 콜러 등. 18이 모델의 lacI 리포터 유전자를 운반하는 λ 파지 벡터를 이용하여 생성 LACI 트랜스 제닉 마우스 모델에 기초한다. 벡터 전염성 파지 입자로 상대적으로 단순 복구 이후의 포장을 허용 측면에서는 두 COS 사이트, E.를 감염하는 데 사용 대장균. 블루 플라크는 파지에 감염된 E.에</em...

대부분의 조직에서 분화 된 세포는 제한된 수명이 있습니다. 기능적 무결성을 유지하기 위해, 수명이 긴, 조직 특이 적 줄기 세포는 지속적으로 차례로 특정 조직의 기능에 필요한 완전히 분화 된 세포에 야기 전구 세포를 생성한다. 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)이라는 과정을 통해 자신의 구획을 보충. 따라서, 줄기 세포들은 따라서 안으로있는 조직의 기능 무결성을 유지할 책임이 있으며, 그것은 그들이이 손상된 DNA를 감지하고 잠재적으로 복구하는 강력한 메커니즘을 갖추고 있습니다 것이 필수적입니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 그들의 자손에 의해 상속 할 수있는 여러 게놈 (유해) 섭동을 획득 할 수있다. 줄기 세포는 유기체의 수명 동안 자신의 게놈을 안전 보호하는 방법을 이해하는 것은 중요한 문제이며, 게놈 불안정성은 암 (1,2 검토) 다른 연령과 관련된 질병에 링크 된 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3-6에서 직접 DNA 수리 및 특정 유형을 측정하는 것이 가능하다는 것을 증명하고있다. 그것은 예를 들어, 조혈 시스템, 이중 가닥의 DNA 나누기 (NHEJ), 후자는 낮은 충실도의 복구 프로세스 인 및 제조, 따라서 위험 증가에 합류 상동 재조합 (HR) 또는 비 동종 말까지 복구 할 수 있다는 것을 발견 오류. 모두가 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 4,5에 활용되고있다, 그러나, 마우스에 초기 조상 세포가 HR 4를 사용하는 반면이 조혈 모세포에서 주로 NHEJ 것 같다. 비슷한 관측 피부 6 줄기 세포를 위해 만들어졌습니다. 흥미롭게도, 인간의 조혈 모세포 HR에서,하지 NHEJ,이중 가닥 나누기 3에 대한 선택의 복구 메커니즘이 될 것으로 보인다. 두 종 사이의 기능적 차이가 실제 또는 단순히 기술이나 실험적인 차이를 나타내는 지 여부는두고 볼 일이다. 손상된 DNA를 복구하는 줄기 세포의 레퍼토리는 기본 절단 수리 (BER), 뉴클레오티드 절단 수리 (NER)과 불일치 수리 (MMR) 등의 DNA 복구 메커니즘을 포함 할 가능성이있다. DNA 손상 이러한 유형의 NHEJ 또는 HR 복구 할 수 없습니다 MMR 수정 기본베이스 불일치 및 삽입 / 삭제 루프 동안 BER과 NER는 단일 가닥 DNA에서 하나 또는 여러 개의 기본 쌍의 병변을 수리 할 책임이 있습니다. 이 개념을 지원하는 것은 HSC 구획 7-9에서 이러한 경로와 이상 중 하나에 변화 사이의 링크를 보여주는 조혈 시스템뿐만 아니라, 골수이 형성 증후군 10-16,에 발생한 질병을 개발의 증가 위험에서 여러 연구하다HSC는 그 질병이 진행됨에 따라 (17)을 게놈 불안정성을 증가와 연관된다. 아직 바와 같이, 직접 조혈 모세포의 BER, NER 및 MMR의 측정은보고되지 않았다. 기계론 수준에서 티슈 무결성을 제어하는 다양한 프로세스를 해명 외에도, 이러한 프로세스 중 하나의 수차의 영향은 유 전적으로 대 정상에서 예를 들면, 테스트 될 수 있도록, 돌연변이 DNA의 정도를 측정 할 수있는 것이 필수적이다 설계 줄기 세포 또는 젊은 대 이전에. 그러나, 중요한 분석의 발전 때문에 조직 특이 적 줄기 세포의 소수와 &quot;stemness&quot;를 유지 배양 조건의 부족으로 인해 곤란하다. 또한, 이러한 분석은 환경 및 유전 적 조작을 수정할 수있는 있어야한다. 이러한 제한 사항 및 요구 사항에 대한 해결 방안이 구체적으로 DNA의 돌연변이를 검출 할 수 있도록 설계되어 마우스 모델을 사용하는 것입니다. MUL돌연변이 검출을위한 tiple 형질 전환 마우스 모델이 개발되었다. 예를 들어, LACI 형질 전환 마우스 (18)는 LACI 유전자가 락 연산자의 억제를 인코딩하고 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. LACI 유전자의 돌연변이에, 락 운영자가 활성화되고, β-갈 락토시다 아제가 생성됩니다. β-갈 락토시다 클리브이 파란색으로 변 발색 기질의 X-GAL (5 - 브로 모 -4 - 클로로 - e-인돌 릴-β-D-갈 락토 피 라노 사이드). LACI 벡터 측면의 COS 사이트는 람다 파지의 단백질과 E. 이후의 감염에 의해 쉽게 복구 할 수 있습니다 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 대장균은 X-GAL 기판을 포함 아가 로스에 패 득점 할 수있다. 분명 플라크가 아닌 돌연변이를 정박하는 동안 블루 플라크, 락-I는 파지를 들고 추정 돌연변이가 포함되어 있습니다. 일 사이에 블루 플라크의 주파수 (전자 명확한 것)는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 더욱이 LACI 타겟을 호스팅 λ 파지가 용이 비교적 높은 처리량 분석 PCR 기법을 사용하여 시퀀싱 될 수있다. 여러 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 차례로 특정 DNA 수리 경로에서 가능한 결함 또는 특정 유전 독성 이벤트를 가리킬 수 변이 스펙트럼에 대한 중요한 정보를 공개합니다. LACI 형질 전환 시스템은 여러 실험실 19 일에 걸쳐 표준화되어 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다. LACI 시스템의 하나의 주요 단점은 대형 삭제 또는 재 배열을 감지하는 능력이 제한적이며, 따라서 중기 확산에 다른 방법, 예를 들어, 멀티 컬러 FISH이 부족을 보완하기 위해 사용되어야합니다. LACI 마우스 모델의 λ 파지 벡터 내에 훨씬 작은 유전자 CII있어돌연변이 분석에 사용할 수 있습니다. 크기와 돌연변이가 선택 될 수 있다는 사실이 LACI 유전자 분석보다 덜 노동 집약적 저렴 세이 20 만든다. 발색 기질 22-25에 대한 표현형 반응을 발생 아미노산 잔기의 명확한 이해가되도록 그러나의 lacI 유전자가 더욱 광범위 돌연변이 (21)와 돌연변이 유전자의 감성 연구되고 잘 특징으로하고있다. 돌연변이 검출을위한 기타 마우스 모델 ΦX174 또는 LacZ를 트랜스 진의 사용을 포함한다. T → G : 원본과 ΦX174 형질 전환 마우스 모델, C의 복귀 돌연변이 시험 26 또는 염기쌍 치환의 스펙트럼의 검출, LACI 모델보다 적은 비용으로 시스템을 나타냅니다 수있는 앞으로 돌연변이 시험 27. 그러나, 앞으로 분석에서 돌연변이 화면이 사소한 돌연변이 사양이 아닙니다ΦX174 전이 유전자의 TRUM은 같은 LACI의 같은 특성이 잘되지 않습니다. LacZ를의 형질 전환 유전자를 운반 마우스 모델에서 LacZ를 돌연변이 기자는 E.을 이용하여 복구 갈락토스와 갈락토스 (28)를 포함하는 매체에 민감한 대장균 숙주 세포. 이 시스템의 단점은 LacZ를 타겟의 회복 또한 E. 결찰 및 일렉트로이어서 제한 효소 분해를 수반한다는 것이다 대장균함으로써 어려운 세포의 수가 적은 시스템에 적응하고, 호스팅합니다. 이 줄기 / 전구 세포 집단 작업을위한 절대적인 요건 (하나는 항상 더 많은 쥐를 시작할 수)은 아니지만 세포의 큰 숫자 (예를 들어 수백만 이상) 필요한 경우, 신속하게 허무하고 엄청난 비용이 될 것입니다. 민감한 돌연변이 리포터를 제공하면서 또한, LacZ를 중에서 비교적 큰 크기, 복잡하고 DNA 서열 분석 및 determ 더 비싸다돌연변이 스펙트럼의 ination. 이 모델의 주요 이점은 있지만, 그것의 큰 삽입 및 결실을 검출 할 수있는 능력뿐만 아니라, 염색체 재 배열이다. LACI, ΦX174 및 LacZ를 트랜스 제닉 마우스 모델에서 모든 셀은 리포터 시스템을 운반하기 때문에, 이러한 마우스 모델 중 어느 한 그들은 확실하게 수납 할 수 있기 때문에, 줄기 및 전구 세포를 포함하여, 그 어떠한 세포 유형에 돌연변이를 측정하기 위해 사용될 수있다 충분한 숫자. 우리가 LACI 마우스 모델과 LACI 돌연변이 분석과 광범위한 경험을 가지고 있기 때문에, 우리는 조혈 줄기 및 전구 인구에서 돌연변이 분석에 대한이 시스템을 추구하기로 결정했다. 조혈 조직은 린의 극히 드문 인구로 식별 장기를 다시 채우기 줄기 세포를 포함하여 개별 구성 요소의 세포 표면 표현형의 측면에서 잘 특징 - IL7R <suP&gt; - 무서-1 + CKIT + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 세포 29. . 그것은 DNA의 수리를 공부에 관해서 세포가 여전히 조혈 모세포에 좋은 대표하고 가장 원시적 인 헌신 골수 전구 (CMP) 집단에서 유의 한 차이 - Mohrin 등 4 LSK/Flk2의 약간 큰 인구는 것을 보여 주었다. 또한, 경우 HSC - 농후 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2 -) - IL7R - 셀 린 비교 하였다 무서 -1 - CKIT + + (LS-K 전구 세포)에있는 상당한 차이가 여전히 있었다 덜 순수한 사이 NHEJ 능력 5, 세포 농축 LSK 인구 및 전구 세포를 줄기. 이 셀의 수는 매우 어렵습니다, 우리는 적어도 2 × 10 5 세포가이 돌연변이 분석에 일관 신뢰할 수있는 결과에 필요한 것을 발견하기 때문에 세포 - 우리의 연구에서 우리는 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2) HSC 강화 사용CD150 + CD48 인구 또는 LSK/Flk2 - - 인구 (마우스, 비용과 실용성 측면에서) 하나가 LSK/Flk2을 정렬 할 때 얻었다. 원래 콜러 등. (18)에 의해 개발 된 하나에 기초하여이 프로토콜은, 자발적인 DNA 돌연변이 빈도가 차별화 골수 세포의 집단뿐만 아니라 분리되지 않은 골수 및 비장 세포 LSK 세포 판단되고 정의 될 수있는 방법을 상세하게 설명한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;LacI &lt;/em&gt;transgenic mice&amp;nbsp;</td><td>BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>DNA size standards &amp;ndash; lambda ladder</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0.025 mM Pore size membranes&amp;nbsp;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Bioassay dishes (trays)&amp;nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>NZY broth (powder)</td><td>Fisher (Teknova)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>PCR Extender Taq Polimerase kit</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP cleanup kit</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

최근, 그것은 게놈 불안정성 단단히 많은 발달 장애, 암, 노화 관련되어 있다는 것이 명백되고있다. 줄기 세포가 생활 전반에 걸쳐 조직의 항상성 및 수리를 보장하는 책임이 있음을 감안할 때, 그것은 줄기 세포 인구는 조직의 게놈 무결성을 보존하는 중요한 가설하는 것이 합리적이다. 따라서, 상당한 관심이 줄기 세포 기초 질환의 병인을 이해하는 것을 목표로, 게놈 줄기 세포의 무결성 및 그들의 자손에서 내인성 및 환경 적 요인의 영향을 평가 생겨났다. LACI 형질 전환 마우스는 LACI 유전자가 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. 돌연변이 LACI 유전자의 결과는 클리브 파란색으로 돌려 발색 기질을, β-갈 락토시다 아제의 생산이다. LACI 기자 시스템은 수행의 i줄기 / 전구 세포를 포함하고 쉽게 복구이어서 E. 감염하는 데 사용할 수있는 모든 셀에 N, 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 정확한 기판을 포함 아가로 오스에 대장균, 패 득점 수 있으며, 맑은 플라크가 야생형 항구 파란색으로 플라크는 돌연변이 LACI 유전자를 나타냅니다. 플라크 (클리어 중) 블루의 주파수는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 유전자의 돌연변이의 위치와 돌연변이의 종류를 표시합니다. LACI 유전자 변형 마우스 모델에서 생체 내 돌연변이 분석으로 잘 확립되어있다. 또한, 분석을위한 마우스 및 시약은 시판되고있다. 여기에서 우리는이 모델이 자발적으로 줄기 세포가 풍부한 린의 DNA 돌연변이 발생 빈도를 측정하기 위해 적용 할 수있는 방법을 자세히 설명 - IL7R - 무서-1 + CKIT + + (LSK) 세포 및 조혈 시스템의 다른 부분 모집단.

<html> 생체 내 돌연변이 분석은 드문 경우 많은 이벤트들 (돌연변이 PFUs) (모든 PFUs)를 측정한다. 세포의 소수로 분석을 수행하여, 그 결과가 상당히 긍정적 거짓 및 위음성 결과에 좌우되는 것이 가능하다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 3 가지 동물로부터 수확 된 분획 골수 세포와 일련의 희석 실험을 수행 하였다. 우리는, 1.4 × 106, 7.0 × 105을 사용하여 이들 동물의 골수에?...

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Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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13.0K 조회수.  UT Health Science Center at San Antonio.  여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다. 

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Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

연구

면역학 및 감염병학

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

유전학

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

발생학

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such as leukemia. Characterizing mutation accumulation can improve understanding of the etiology of age-associated diseases. Presented here is a method to catalogue somatic mutations in individual HSPCs, which is based on whole-genome sequencing (WGS) of clonal primary cell cultures. Mutations that are present in the original cell are shared by all cells in the clonal culture, whereas mutations acquired in vitro after cell sorting are present in a subset of cells. Therefore, this method allows for accurate detection of somatic mutations present in the genomes of individual HSPCs, which accumulate during life. These catalogues of somatic mutations can provide valuable insights into mutational processes active in the hematopoietic tissue and how these processes contribute to leukemogenesis. In addition, by assessing somatic mutations that are shared between multiple HSPCs of the same individual, clonal lineage relationships and population dynamics of blood populations can be determined. As this approach relies on in vitro expansion of single cells, the method is limited to hematopoietic cells with sufficient replicative potential.

Somatic mutation patterns in cells reflect previous mutagenic exposure and can reveal developmental lineage relationships. Presented here is a methodology to catalogue and analyze somatic mutations in individual hematopoietic stem and progenitor cells.

인간의 혈액의 돌연변이 하중과 클론 구성 특성화

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell disease. This observation has tremendous implications, as subsequent therapeutic immunomodulation strategies can improve clinical outcome. Conventionally, polymerase chain reaction-based analysis of short tandem repeats is used to identify chimerism in donor-derived blood cells. However, this method is restricted to nucleated cells and cannot distinguish between dissociated single-cell lineages. We applied the analysis of short tandem repeats to flow cytometric-sorted hematopoietic progenitor cells and compared this with the analysis of short tandem repeats obtained from selected burst-forming unit - erythroid colonies, both collected from the bone marrow. With this method we are able to demonstrate the different proliferation and differentiation of donor cells in the erythroid compartment. This technique is eligible to complete current monitoring of chimerism in the stem cell transplant setting and thus may be applied in future clinical studies, stem cell research and design of gene therapy trials.

Quantification of donor-derived cells is required to monitor engraftment after stem cell transplantation in patients with hemoglobinopathies. A combination of flow cytometry-based cell sorting, colony formation assay, and subsequent analysis of short tandem repeats may be used to assess the proliferation and differentiation of progenitors in the erythroid compartment.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

암 연구학

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. However, the accumulation of cancerous mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can block normal differentiation, induce aberrant proliferation, and ultimately lead to leukemogenesis. To identify and/or evaluate the cancerous mutations, we integrated CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to investigate a model gene Trp53, that is essential for abnormal proliferative ability of HSPCs. Specifically, bone marrow cells enriched for HSPCs from Cas9 mice were harvested and then subjected to viral transfection with single-guide RNAs (sgRNAs) targeting one or several candidate genes to introduce genetic alterations in HSPCs. Then, a CCK-8 assay was performed to investigate the proliferative capacity of transfected HSPCs. The sgRNA targeting efficiency was confirmed by a Tracking of Indels by Decomposition assay. These identified genes may play crucial roles in leukemogenesis and could serve as potential therapeutic targets.

Here, we present a protocol that integrates CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to identify candidate genes that are crucial for the abnormal proliferative capacity of hematopoietic stem and progenitor cells.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

생물학

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.