박테리아가 너무 작기 때문에 사람들은 종종 3 차원 물체를 잊어 버리십시오. 우리의 프로토콜은 평평한 세포와 곡선 셀의 모양을 정확하게 재구성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 현미경에 약간의 수정만 필요하며 MATLAB 스크립트에서 쉽게 사용할 수 있습니다.
실험을 시작하기 전에 단일 유리 현미경 슬라이드의 반대쪽 끝에 각각 3 개의 20 x 20 밀리미터 커버 슬립의 두 스택을 배치합니다. 아가로즈 패드 용액의 파이펫 200 마이크로리터는 슬라이드에 즉시 두 번째 슬라이드를 덮 전표 더미에 놓고 아가로즈를 평평하게 합니다. 아가로즈가 실온에서 약 1분 동안 고화되도록 허용한 후 조심스럽게 상단 슬라이드에서 미끄러져 200 마이크로리터 파이펫 팁의 큰 끝을 사용하여 젤에서 개별 5밀리미터 직경 패드를 잘라냅니다.
모든 패드가 파이펫을 획득했을 때 E.coli 세포 배양은 모든 세포 덩어리를 방해하고 세포가 각 패드에 소양소 1마이크로리터를 추가하기 전에 균질적으로 분포되도록 여러 번 배양한다. 샘플을 5-10분 동안 건조하게 한 후, 커버 슬립을 패드에 놓기 전에 물방울이 패드에 완전히 흡수되었는지 확인합니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 커버 슬립의 가장자리 주위에 적절한 실란트를 부드럽게 브러시하여 실란트를 커버 슬립 상단에서 멀리 유지하십시오.
커버 슬립을 밀봉한 직후 슬라이드를 현미경 단계에 배치하고 5분간의 열 평형을 통해 현미경 초점 휠을 사용하여 세포의 중간을 초점으로 데 넣습니다. ND 획득 하에 있는 관련 현미경 소프트웨어에서 Z 상자를 선택하여 Z 스택을 획득하고 홈 버튼을 클릭하여 셀의 중간을 시작점으로 설정합니다. 단계 크기를 0.1 마이크로미터로 설정하고 범위를 4 마이크로미터로 설정하고 Z 장치가 Piezo 단계로 설정되어 있는지 확인합니다.
셀이 배경과 거의 구별할 수 없도록 셀의 위쪽과 하단모두에 충분한 흐림이 있는 것이 중요합니다. 람다 창 아래형 채널을 이미지화되는 형광 분자의 설정으로 설정하고 전환하기 전에 각 색상 채널에서 완전한 Z 스택을 얻을 수 있도록 실험 순서가 람다로 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다.
모든 이미지를 획득하면 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 파일을 엽니다. 개별 셀 주위에 상자를 그리고 각 채널에 대해 한 번 두 번 해당 셀을 복제하여 중복 하이퍼스택 상자를 선택했는지 확인하고 채널을 하나 또는 두 개로 변경합니다. 두 스택을 모두 사용할 수 있게 되면 이미지, 스택, 도구 및 연결하여 이미지를 결합합니다.
단백질 채널을 먼저 하고 모양 채널이 두 번째로 들어오게 됩니다. TIFF 파일로 새 이미지를 저장한 후 자른 이미지와 cell_shape_settings_tri 포함하는 바탕 화면의 폴더 내부의 폴더를 만듭니다. 셰이 셀셰이프 퍼블릭 exampleData_tri txt 파일.
cell_shape_settings_tri 편집합니다. txt 파일은 관심있는 실험에 대한 올바른 설정을 갖습니다. 그리고 문자열을 폴더 위치로 Cell_shape_detector3dConvTriFolder 함수를 실행한 다음 시작할 셀 수와 실행해야 하는 셀 수를 따릅니다.
셀이 제대로 재구성되었는지 확인하려면 ScreenFits를 실행합니다. 그래픽 사용자 인터페이스가 열리면 폴더 선택 단추를 클릭하고 재구성 데이터 파일이 있는 폴더를 선택하여 개별 셀 재구성을 시각적으로 검사합니다. 모양이 잘못 되거나 전체 커버리지가 부족한 셀의 경우 다운스트림 분석에서 제외될 수 있도록 이름에 플래그를 부속시키기 위해 재구성 옆에 있는 상자를 선택합니다.
농축을 실행SmothingSpline표면에서 가우시안 곡률의 기능으로 관심있는 단백질의 상대적 농도의 농축 프로파일을 생성합니다. 그런 다음 방금 만든 TRI로 각 폴더를 선택합니다. 새로 만든 커브 매트 파일을 선택합니다.
이 방법은 2D 표현이 세포의 곡률을 정확하게 반영할 수 없기 때문에 곡선 또는 비정상적으로 모양의 세포를 다룰 때 특히 유용합니다. 본 실험에서 세균성 액틴 단백질 MreB에 대한 녹색 형광 융합 단백질은 야생형 및 돌연변이 대장균 세포 모두에서 액틴 단백질의 정확한 국소화를 연구하기 위해 생성되었다. 이러한 측정을 3D로 캡처한 이미지로 함으로써 야생 유형과 rodZ 돌연변이 세포의 모양을 재구성할 수 있었습니다.
MreB의 현지화는 rodZ 종속 방식으로 3D로만 측정할 수 있는 기하학적 특징인 작은 가우시안 곡률에서 농축되기로 결정되었습니다. Z 스택이 셀이 위쪽과 하단에 흐려지고 세포가 서로 잘 간격이 있는지 확인할 수 있습니다. 우리는 3D에서 단백질의 기하학적 국소화화를 측정하는 방법을 보여주고 있지만 태그 단백질 어셈블리의 크기와 같은 이 데이터에서 다른 정보를 계산할 수 있습니다.
