우리는 도움을 CIBIO (트 렌토 대학)과 CNR 신경 과학 연구소의 행정 직원을 감사드립니다. 조반니 Provenzano는 Fondazione Veronesi (밀라노, 이탈리아)에서 박사 후 친교에 의해 지원됩니다. 이 작품은 이탈리아 대학의 연구부 (PRIN 2008 부여 # YB에 200894SYW2_002 및 PRIN 2,010에서 2,011 사이 부여 # 2010N8PBAA_002), 트 렌토 대학교 (YB에 CIBIO 스타트 업 허가) 및 텔레 톤 재단 (에 부여 # 1 GGP13034에 의해 투자되었다 YB).

모든 실험은 유럽 공동체 지침 63분의 2,010 / 유럽 연합 (EU)에 부합 실시하고, 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었다. 1. 동물 관리, 주택 및 치료 <ol><li> 각각의 기관 동물 관리의 지침에 따라 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 음식과 물을 사용할 수 임의로와 12 시간의 빛 / 어둠주기에서 동물을 유지한다. </li><li> 하우스는 톱밥과 침구 재료와 표준 크기의 폴리 카보네이트 마우스 케이지에서 2-4의 그룹에서 마우스는 매주 변경. </li><li> 질병에 대한 감수성이 신경 발달 장애의 다른 마우스 모델에서 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에, 연령과 성별 일치 마우스를 사용합니다. </li><li> 통계적 유의성 (행동 연구에 대한 유전자형 당 10 마우스 및 면역 조직 화학 실험에 대한 유전자형 당 4 마우스의 최소)에 도달하는 동물의 적절한 수를 선택합니다. </li></ol> 2. 모리스 물 미로 (MWM) <ol><li> 원형 탱크 (지름 100cm, 높이 50cm)를 사용합니다. <ol><li> 탱크 주위의 객실 디바이더에 시각적 단서를 놓습니다. </li><li> 4 개의 상상의 사분면 (quadrant) 중 하나의 중심에 고정 된 위치에서 탱크로 10cm 직경 플랫폼을 놓는다. 모든 교육 세션에 걸쳐 모든 시험에 대해 동일한 사분면에 숨겨진 플랫폼을 유지합니다. </li><li> 플랫폼이 수면 위에 1cm 때까지 수돗물로 풀을 입력합니다. 평형 물 온도는 22 ° C에 가까워 야합니다; 이 단계는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 물 온도가 평형에 요구되는 시간을 단축하는 것이 온수를 추가한다. </li><li> 물이 불투명하기 위해 흰색, 무독성 페인트의 약 1.5-2 L을 추가합니다. </li></ol></li><li> 트랙 취득 절차 <ol><li> 표준 CCD 카메라와 비디오 보드와의 MWM 추적 시스템을 설정한다. 이러한 경로 길이와 같은 여러 변수를 모니터링하고 분석하는 비디오 추적 시스템을 선택 ESCA체육 대기 시간 및 시간은 각 사분면에 보냈다. </li><li> 네 사분면에 경기장을 나누고 라이브 추적을위한 동물과 배경 사이의 최적의 대비를 보장하기 위해 탐지 설정을 조정합니다. </li><li> 플랫폼 영역을 지정합니다. </li><li> 60 초와 최대 시험 시간을 설정합니다. </li></ol></li><li> MWM 테스트 <ol><li> 행동 테스트에 앞서, 쥐에게이 풀 또는 공간 큐를 볼 수없는 지역에서 20 ~ 25 분의 적응 기간을 허용합니다. </li><li> (그들 사이에 20 ~ 30 분 간격으로, 하루에 두 개의 연속적인 시련을) 구일 각 마우스를 훈련. </li><li> 컴퓨터와 카메라를 켜고 비디오 추적 시스템 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 꼬리로 마우스를 가지고 머리가 네 시작 위치 (북쪽, 남쪽, 동쪽, 서쪽) 중 하나에서 시작, 풀의 측면으로 지적으로, 물에 넣습니다. 각 마우스의 경우, 시작 위치는 다른과 시련을 통해 pseudorandomized해야한다. </li><li> 마우스 수영을하자 platf 검색60 초의 최대 ORM. 동물이 플랫폼에 도달하면, 그것은 20 초 동안 플랫폼에 머물 수 있습니다. </li><li> 마우스가 그 시간 내에 플랫폼의 위치를​​ 실패하면, 부드럽게 꼬리를 잡고, 플랫폼에 마우스를 안내하고 20 초 동안 거기에 머물 수 있습니다. 동물이 모두이 시험을 완료하면, 수건으로 닦아 건조와 케이지에 다시 넣어. </li><li> 훈련 기간 매일, 동일한 절차 (단계를 2.3.4-2.3.6) 반복합니다. </li><li> 마지막 훈련 흔적 후 9 일에 프로브 테스트를 수행합니다. </li><li> 풀에서 플랫폼을 제거합니다. </li><li> 마우스 수영을하자 60 초 최대의 플랫폼을 검색합니다. </li><li> 주기적으로, 그것은 동일한 (22 ° C)이어야되도록 수온을 확인 풀을 청소. </li></ol></li></ol> 관류 동물에서 섹션 3. 준비 <ol><li> MWM의 끝에서 마우스를 희생한다. 유전자형 당 네 개의 마우스는 euthaniz하기 전에 마취해야지역 및 국제 가이드 라인에 따라 ATION. </li><li> (출혈을 허용하는 가위 auriclewith 권리를 잘라 관류하는 좌심실에 나비 정맥을 소개)로 transcardially 동물을 관류 10 ~ 15를위한 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 다음 인산염 완충 생리 식염수 4-5 분 (PBS)로 분 (22). </li><li> 해부 적어도 12 시간 동안 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 머리를 포스트 - 수정. </li><li> 슬라이스에 필요한까지 4 ℃에서 15 0.1 M PBS에서 0.02 % 아 지드 화 나트륨 ml의 저장을 포함하는 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 튜브의 두뇌를 놓습니다. </li><li> 잘라 vibratome 절단하기 전에 소뇌를 제거합니다. </li><li> vibratome의 홀더 판에, superglue를 사용하여 절단 사이트와 뇌를 똑바로 접착제. </li><li> 적절한 vibratome에, 지느러미 해마에 걸쳐 일련 위해, 20 ~ 40 μm의 두께 코로나 섹션으로 뇌를 잘라. </li><li> 페인트 브러시와 vibratome 슬라이스를 수집하고 2로 전송각 웰에 0.1 M PBS 1 ㎖를 함유하는 4 멀티 웰 플레이트. </li><li> 4 ºC에서 PBS에서 0.02 % 아 지드 화 나트륨의 PBS에 단기 또는 장기 저장 섹션 (조직은 최대 1 년까지 사용할 수 있습니다). </li></ol> 4. 면역 조직 화학 <ol><li> 전송 각 웰에 0.1 M PBS 500 μL를 포함하는 24 멀티 웰 플레이트에 각 마우스 3-5 등의 해마 부분. </li><li> 0.1 M PBS 500 μL (5 분, 부드러운 떨고 3 회) 잘 각각에 포함 된 부분을 씻으십시오. </li><li> 교반과 함께 20 분 동안 PBS에서 1 % H 2 O 2 섹션을 배양하여 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 켄 칭하고. </li><li> 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 조직 투과성으로는 : PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 5 분 동안 배양 섹션. </li><li> 위의 단계 (4.4, 4.5) 동안, (한 접점 전체 실험에​​ 대한 충분한 차단 버퍼 (PBS에서 10 % 염소 혈청과 0.1 % 트리톤-X100)를 만들섹션의 R × 100 μL × 3 단계). </li><li> 주 : (비오틴에 접합) 이차 시종되었다되는 동일한 종으로부터의 혈청을 사용. </li><li> 교반과 함께, 실온 (RT)에서 1 시간 동안의 버퍼 (100 μL / 제)를 차단 섹션을 배양하여 비 특이 적 항체의 결합을 방지. </li><li> 교반과 함께, 4 ° C에서 하룻밤, 버퍼를 차단에 희석 차 Ab의 (PERK)에서 섹션을 품어. </li><li> 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 교반과 함께 RT에서 1 시간 동안 (단계 4.6에서 사용 된 것과 동일)를 차단 완충액에 희석 : 바이오틴 (250 1)와 접합 이차 Ab의 함께 인큐베이션. </li><li> 아비딘 및 비오틴 복잡한 실온에서 적어도 30 분을 필요로하기 때문에, 동시에 ABC 시약을 준비한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 ABC 시약의 필요한 양을 준비합니다. </li><li> 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> IncubatABC 시약을 실온에서 45 분 동안 전자 섹션. </li><li> 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> DAB 솔루션 작업 준비 DAB 발암 및 기형이기 때문에, DAB와 관련된 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫으로 새로운 판에 DAB 솔루션을 전송합니다. </li><li> 손으로 솔루션 천천히 소용돌이 판을 작업 DAB를 포함하는 판에있는 장소 섹션, 섹션에 최대 노출을 허용합니다. </li><li> 적절한 신호가 개발 될 때까지 현미경에 DAB 반응 (2-5 분)을 모니터링합니다. </li><li> 0.1 M PBS (3 × 5 분)에 조직을 세척하여 원하는 색상 강도로 반응을 정지. </li><li> 하룻밤 흄 후드에 남아있는 DAB 기판 솔루션을 비활성화하고 실험실 규정에 따라 폐기하기 위해 표백제를 사용합니다. </li><li> 젤라틴의 마운트 부분은 PBS에 부유하여 슬라이드를 코팅. 실온에서 3-4 시간 이상에서 말린다. </li><li> 50 %의 부분을 순차적으로 탈수, 70 %, 95 %100 % 2 분마다 에탄올, 5 분 동안 100 % 크실렌 명확하고. </li><li> 설치 매체를 사용하여 coverslip에 밤새 건조 흄 후드에 둡니다. </li></ol> 5. 세포 수 <ol><li> 카운트 특권 양성 세포는 등쪽 해마의 수준에서 3-5 절은 동물별로 분석해야한다. </li><li> 적당한 현미경을 사용하여 200 배의 배율로 각 섹션에서 여러 명 시야 이미지를 수집하고, 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 조립한다. </li><li> ImageJ에 무료 소프트웨어를 사용하여 TIFF 변환 모자이크 이미지에 세포 수를 수행합니다. </li><li> 100 × 100 ㎛ 각의 2-3 계산 상자를 통해 hilus 및 과립 세포층의 특권 - 염색 된 세포를 계산합니다. </li><li> 세포 밀도는 카운팅 창 (100 × 100 ㎛) 당 표지화 된 세포의 수로서 표현 될 것이다. </li><li> 유전자형 사이에 유의 한 차이를 평가하기 위해 통계 분석을 수행합니다. 이것은 스튜던트 t로 달성 될 수있다테스트 또는 ANOVA 상용 소프트웨어를 사용하여 해당 게시물을 임시 테​​스트 하였다. P &lt;0.05에서 설정 통계적 유의 수준. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어

- / - 마우스, 신경 발달 장애의 마우스 모델 여기서 우리는 신경 EN2에 MWM을 다음 활성화를 공개하기위한 특권 면역 조직 화학 프로토콜을 제공합니다. - / - 특권 레벨의 감소 EN2 CA3의 서브 필드에서 검출 된 돌연변이 WT에 비해. 다르게 CA3 서브 필드, 특권 양성 신경 세포의 일반적인 증가에서 관찰 된 것과 대신 모두 hilus에서 검출되었고, EN2의 GCL - / - 마우스 (WT)에 비해. ERK?...

신경 발달 장애와 같은 중추 신경계 (CNS)의 발달 및 성숙은 초기의 교란되는 다운 증후군, 깨지기 X 증후군 (FXS), 레트 증후군, 신경 섬유종증, 결절성 경화증 ASD 같은 장애의 다양한 이기종 기가 포함 산전 기간 1. 이러한 발달 뇌 기능 장애는 운동 기능, 언어, 학습과 기억 과정에 깊은, 평생 효과가 발생할 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 과다는 지난 몇 년 동안 2,3- 신경 발달 장애의 병인에 연루되어왔다. 임상 적 표현형을 기본 분자 메커니즘은 알려지지 남아 있더라도, 상술 한 결과는 이런 질환의 여러 마우스 모델의 개발을 허용했다. 학습 및 기억 결핍은 이러한 TSC1 +/- +/-, TSC2 이러한 마우스 모델에서 식별 번호되었습니다NF1 + 및 EN2 - / - 마우스 2,4-7. 신경 발달 장애의 분야에서 중요한 과제는 세포 및 분자 적 프로세스 메모리를 기본 및 학습의 기능 장애를 식별한다. 학습 또는 메모리 동안 활성화 선택한 신호 경로는 특정 유전자의 전사를 유도하고 궁극적으로 드 노보 단백질 합성으로 이어질 수 있습니다. 즉시 - 초기 유전자 (IEGs) 활성화 및 단백질에 의존하는 시냅스 수정은 빠르게 연결 활동 및 행동 훈련 8,9에 대한 응답으로 뇌의 신경 세포에서 유도된다. neurofibromin을 포함하는 신호 전달 경로의 적자는 신경 발달 장애의 장애 학습과 관련이있다. Neurofibromin 누구의 변이 신경 섬유종증 제 1 형, 복잡한 유전 적 증후군은 신경계 종양, 행동 및 모터 지연,인지 DISA 특징으로 원인 NF1 유전자의 제품이다bilities 10. 억제 뉴런에 제한 NF1 삭제에 대한 마우스의 이형은 MWM 5,11,12의 장기 강화의 초기 단계 (LTP)뿐만 아니라 손상된 공간 학습 결손을 보여줍니다. 흥미롭게도,이 마우스 모델에서 NF1 결핍이 증가 ERK의 인산화에 마지막으로 이러한 뉴런 5에서 GABA 릴리스의 이상 향상의 결과로 학습하는 동안 억제의 interneurons에서 라스 신호의 오버 활성화로 연결됩니다. 이러한 발견에 기초하여, 행동 작업 후 신경 활성의 시각화는 신경 발달 질​​환에 관여하는 특정 회로를 재구성 할 수있는 방법을 나타낸다. 여기에 설명 된 면역 프로토콜은 평가하고인지 결핍과 ASD 마우스 모델을 MWM 다음 해마 ERK 인산화 수준을 정량화하는 것이다. MWM 널리 설치류 13, 14의 해마에 의존 공간 학습과 기억을 조사하는 데 사용됩니다 </s&gt;까지. 우리는 ERK는 학습과 기억 형성 (15)에 필수적인 역할을하는 것으로 되었기 때문에, 작업에 의존하는 해마 학습의 분자 판독으로 ERK의 인산화를 사용하기로 결정. 또한, ERK 경로는 개발 시각 피질 (16)의 경험에 의존하는 소성 필요합니다. 마지막으로, CNS 쇼 두 ERK 이성체 (ERK2) 중 하나가 결여 된 마우스는 ERK 신호는 ASD 같은 신경 발달 장애의 발병 기전에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타내는,인지 감정적 사회적 행동 (17)에 이상을 표시했다. 신경 발달 장애의 모델로 마우스 (- - / EN2) 우리는 Engrailed 2 녹아웃을 사용했다. EN2 - / - 마우스는 전뇌의 interneurons (18)의 손실을 포함하여 해부학 적 및 행동 &quot;ASD 같은&quot;기능, ASD 관련 유전자 (19)의 감소 표현을 보여, 사교성을 감소하고, 장애인지 적 유연성 6,7,20. 공간 learniNG 및 MWM에서 검출 된 것과 같은 메모리 결함, EN2 ​​특히 견고 - / - 마우스 6,7 및 ASD 환자 21에서 관찰 된인지 장애와 관련이 있습니다. - / - 성인 마우스 (7) 또한, 우리는 MWM에 손상 공간 학습이 감소 neurofibromin의 발현과 연관 EN2의 hilus의 특권 레벨을 증가 것으로 나타났다. 여기에서 우리는이 ASD 마우스 모델에서 MWM을 다음과 특권의 면역 조직 화학적 특성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

인산화 된 세포 외 조절 키나아제 (PERK)의 유도는 학습에 의존하는 신경 활성화의 안정적인 분자 판독입니다. 여기, 우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하는 특권 면역 프로토콜을 설명합니다. 마우스, 자폐증 스펙트럼 장애의 모델 (ASD) 특히, 우리는 모리스 물 미로 Engrailed-2 녹아웃에 (MWM, 고전 해마에 의존하는 학습 과제) (- - / EN2) 다음 신경 세포의 활성화를 연구하는 특권 면역 염색을 사용했다. 야생형 (WT) 대조군과 비교 된 바와 같이, EN2 ​​- / - 마우스는 MWM 상당한 공간 학습 결핍을 보였다. WT 동물과 비교하여, 마우스 - / - MWM 후에 특권 양성 뉴런의 수에 큰 차이가 특정 해마 EN2의 서브 필드에서 검출된다. 따라서, 우리는 견고하게 프로토콜의 차이를 검출 할 수있다ASD의 마우스 모델에서 해마에 의존하는 학습 장애에 관련된 특권 양성 신경 세포. 보다 일반적으로, 우리는 프로토콜인지 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에서 해마의 신경 세포 활성의 프로파일을 조사하기 위해 적용될 수있다.

여기에 설명 된 프로토콜이 면역 조직 화학에 의해, 가시화하기 위해 설계되었으며, 신경 발달 장애의 마우스 모델에서 MWM 후에 해마의 신경 세포 활성의 특이 마커의 발현. 여기에 기술 된 모든 실험 데이터는 우리의 최근 연구 7에서 촬영되었다. 남성과 여성 (WT) 및 EN2 - / - (3-5개월 된 중량 = 25-35g) 연령대 성인 한배 새끼 이형 교배에서 얻은 사용 하였다. 스물 두 마우스 (유전자?...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K 조회수.  University of Trento.  우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

공간 탐색 구역에서 &#39;학습 연구에 적외선 분광학 가까이 MazeSuite 및 기능 사용

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hippocampal 인슐린 Microinjection 및<em&gt; 생체에</em공간 메모리 테스트 기간 동안&gt; Microdialysis

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

퇴행성 신경 질환의 초파리 모델에서 등반 결함의 정량 분석

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em&gt; 인 체외</em&gt; 허혈

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

작은 Squamate 파충류에서 공간 학습 및 메모리 평가

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Methods Article

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화