이 접근법은 건강하고 병든 뇌를 발달시키는 데 장기간에 걸쳐 이식 된 인터 뉴런의 세포 정체성, 통합 및 기능을 조사 할 수있게합니다. 이 프로토콜은 순진하고 형질 전환 마우스의 해마로 생존하고 성숙하는 전구체와 같은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 인터 뉴런의 빠르고 효율적인 생성을 설명합니다. 이 접근법은 인터뉴런이 손상된 발달 장애에서 세포 요법을 사용하는 치료 잠재력을 평가하는 데 도움이 됩니다.

시작하려면 인간 유래 인터뉴런 전구체에서 세포 배양 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 조심스럽게 헹굽니다. 400 마이크로 리터의 세포 분리 용액을 6 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 세포의 경계가 반짝이기 시작할 때까지 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2-3 분 동안 배양하십시오.

그런 다음 6웰 플레이트의 각 웰에 600마이크로리터의 신선한 N2 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중지하고 피펫을 사용하여 세포를 기계적으로 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 현탁액을 플라스틱 튜브로 옮기고 실온에서 4분 동안 180G에서 원심분리합니다. 진공 시스템을 사용하여 상청액을 버리고 펠렛을 이식 배지에 재현탁시킨다.

계수 챔버 및 탈리 카운터를 사용하여 현탁액 중의 총 세포를 계수하고, 마이크로리터당 100, 000 세포의 최종 농도로 부피를 조절한다. 최대 4 시간 동안 이식 될 때까지 얼음 위의 밀폐 된 튜브에 세포 현탁액을 보관하십시오. 마취 직후, 강아지를 젖은 얼음 표면의 젖은 티슈에 3 분 동안 올려 놓고 상지가 희끄무레해질 때까지 놓습니다.

피펫으로 세포를 조심스럽게 재현탁하고 주사기에 세포 현탁액을 로드합니다. 강아지를 정위 프레임에 놓고 이어 바를 반대 방향으로 사용하여 강아지를 배치하십시오. 다음으로, 에탄올에 담근 연조직을 사용하여 피부 표면을 청소하십시오.

lambda를 식별하고 입체 계측기의 디지털 디스플레이 콘솔에서 좌표를 0으로 설정합니다. 해밀턴 주사기를 원하는 좌표로 재배치 한 후 90도 구부러진 인슐린 바늘을 사용하여 두개골을 관통하여 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 바늘이 두개골을 가로 지르고 배복부 좌표가 0이 될 때까지 해밀턴 주사기를 내립니다.

원하는 배복부 좌표가 달성 될 때까지 바늘을 내립니다. 줄기 세포가 주입되면 바늘을 천천히 수축시킵니다. 강아지가 움직이기 시작할 때까지 손으로 강아지를 데우고 어미에게 돌려주는 절차를 종료하십시오.

Iba1, CD68 및 galectin-3을 사용하여 확인 된 반응성 미세 아교 세포의 부재로 평가 된 바와 같이 이식 된 세포에 대한 면역 반응 또는 국소 염증은 출생 후 14 일 또는 이식 후 2 개월에 발견되지 않았습니다. 성상 교세포의 정도는 신경교 섬유 산성 단백질 및 염증성 사이토 카인, 예를 들어 인터루킨 -1 및 세포 독성 림프구의 부재에 의해 결정됩니다. Cntnap2 녹아웃 마우스에서, 인간 줄기 세포 유래 인터 뉴런 유사 세포는 이식 후 최대 9 개월까지 생존했으며 주사 부위에 국한되었다.

그러나 그들은 또한 야생형 마우스에서 관찰 된 것처럼 동측 및 반대측 해마에 분산되었습니다. 이 프로토콜은 뇌의 혼란과 압축을 최소화하고 절차 속도와 좌표의 정밀도 사이의 균형을 잘 유지하기위한 연습이 필요합니다. 이 프로토콜은 연구, 관심 질문에 따라 연결 연구 또는 전기 생리학 또는 행동 연구와 같은 기능 판독과 같은 다양한 기술과 호환됩니다.