이봐, 얘들 아, 내 이름은 왕양동, 나는 웨스트 레이크 대학에 박사 키릴 피아트케비치 분자 바이오 엔지니어링 연구소에서 해요. 오늘, 나는 당신에게 마우스에서 해마의 신경 활동을 이미징절차에 대한 절차를 보여 줄거야, 생체 내. 용접 기를 켜고 필요한 온도까지 가열합니다.
그림과 같이 도움의 손을 사용하여 이미징 캐뉼라와 주사 캐뉼라의 위치를 조정합니다. 바늘을 사용하여 소량의 적절한 유형의 플럭스를 이미징과 주입 캐뉼라 사이의 연결 반점에 5초 동안 적용한 다음 물방울을 제거합니다. 납땜 주석을 마운트하고 플럭스로 처리 된 연결 지점에 적용합니다.
그것은 수술 하는 동안 만들기 위해 불필요한 더 큰 두개골을 필요로 하므로 과잉 납땜 주석을 피하십시오. 납땜 주석이 식을 때까지 기다립니다. 일반적으로 몇 초가 걸립니다.
사출 캐뉼러가 양방향에서 더미 캐뉼라를 삽입하여 차단되지 않는지 확인합니다. 이쑤시개 또는 26게이지 주사기 바늘을 사용하여 이미징 캐뉼라의 하단에 UV 경화 광학 접착제를 적용합니다. 미세 트위저를 사용하여 해당 크기의 커버 유리를 이미징 캐뉼라에 조심스럽게 배치합니다.
표준 핸드헬드 UV 램프에서 UV 조명으로 최소 한 시간 동안 접착제를 치료합니다. IACUC 승인 절차에 따라 이소플루란으로 마우스를 마취시화합니다. 수술 가열 패드 위에 스테레오 탁스 프레임에 마우스를 배치합니다.
이어 바으로 머리를 고정하십시오. 머리를 사방으로 살짝 밀어 머리를 단단히 고정시합니다. 수술 중 동물의 눈이 건조되는 것을 방지하기 위해 눈 연고를 적용하십시오.
트리머 또는 탈필 크림을 사용하여 목 뒤쪽에서 눈까지 털을 제거합니다. 베타딘으로 수술 부위를 살균한 후 70%에탄올을 세 번 이나 절개를 합니다. 두개골 의 상단에 피부를 제거, 머리의 모든 주위에 수평 컷으로 시작, 거의 눈꺼풀에 도달, 장밋 방향으로 두 컷 다음.
그런 다음 중간선에 수렴되는 두 개의 경사 컷. 두 개의 멸균 면봉으로 연결 조직뿐만 아니라 목 뒤쪽의 근육을 두개골 가장자리까지 철회하십시오. 과도한 통증을 피하기 위해 2 분 동안 periosteum표면에 리도카인 용액 을 떨어 뜨립니다.
두개골의 노출된 부위 전체를 메스로 부드럽게 긁어 내어 건조하고 거친 표면을 만듭니다. 바늘끝을 람다상에 놓아 AP 좌표가 0인지 확인하여 헤드 위치가 수직인지, ML 좌표가 0인지 확인하여 헤드가 수평으로 위치하는지 확인한다. 그렇지 않은 경우 AP 및 ML 좌표가 모두 0.1밀리미터 이내일 때까지 스테레오탁스 스테이션에서 특파원 노브를 조정합니다.
바늘 끝을 이동하여 두개골 절제술에 대한 해당 지점을 찾고 미세 마커를 사용하여 두개골에 자신의 위치를 표시합니다. 4개의 표시된 점을 기반으로 원을 그리며 원의 캐뉼라 측에 주입 캐뉼라 영역의 윤곽선을 그립니다. 분당 10, 000 라운드의 속도로 공압 드릴을 사용하여 두개골에 표시된 윤곽선을 따라 부드럽게 드릴수 있습니다.
두개골을 매우 얇은 뼈 층이 남을 때까지 드릴링하면 일반적으로 중앙에서 부드러운 터치로 흔들리기 시작합니다. 두개 내술의 중심에 멸균 PBS 한 방울을 바르는다. 매우 얇은 팁 집게 또는 두 개의 26 게이지 바늘반대쪽에서 접근 두개골에서 뼈 플랩을 들어 올립니다.
PBS를 적용한 다음 부드러운 포부를 적용하고, 26 게이지 무딘 바늘을 여러 번 통해 두라의 표면을 청소하십시오. 피질과 해마 위의 코퍼스 캘로섬을 제거하려면 부드러운 흡입을 적용하십시오. 피질은 종종 코퍼스 캘로섬보다 더 황색입니다.
그리고 코퍼스 캘로섬은 일반적으로 해마보다 넓습니다. 게다가, 코퍼스 Callosum은 상단에서 관찰 할 때 수직 및 수평 방향으로 가는 신경 섬유에 의해 구별하기가 정말 쉽습니다. 이 시점에서 출혈은 두개 내의 뇌 조직의 가시성에 영향을 미칩니다.
PBS를 적용한 다음 부드러운 흡입을 하고 피질을 흡입하는 동안 코퍼스 캘로섬은 다이어그램에 비응하여 흰색 섬유의 방향으로 인식할 수 있습니다. 원형 모션에 부드러운 흡입을 적용하여 층별로 코퍼스 캘로섬 섬유 층을 제거합니다. PBS는 지속적으로 노출 된 뇌 조직 위에 축적 혈액을 제거하기 위해 적용된다.
임플란트를 두개골 절제술에 부드럽게 삽입합니다. 임플란트의 표면을 해마의 노출 표면에 최대한 가깝게 배치하기 위해 L자 형 바늘로 임플란트 위에 단단히 누릅니다. 임플란트 주변의 흉터에 PBS를 반복적으로 적용한 다음, 임플란트 삽입 시 혈액을 최대한 제거하는 흡입을 합니다.
임플란트와 두개골 사이에 빠른 물개 층을 가늘게 발라 치과 시멘트가 두개골 아래에 침투하는 것을 방지합니다. 빠른 씰이 경화되면 두개골 표면, 빠른 씰 표면 및 임플란트 표면에 슈퍼 본드를 고르게 적용하십시오. 슈퍼 결합이 경화되면 수술 초기에 만들어진 절개 주위의 피부뿐만 아니라 슈퍼 결합 위의 의치 베이스 수지를 적용하십시오.
의치 베이스 수지가 경화 된 후, 임플란트 주위에 수지에 헤드 플레이트를 놓고 이미징 캐뉼라로 농축합니다. 헤드 플레이트 주변에 더 많은 틀니 베이스 수지를 적용하여 위치를 수정합니다. 몇 분 동안 치료하자.
이미징 창에 더 잘 접근할 수 있도록 캐뉼라 주위에 두꺼운 시멘트 층을 쌓지 마십시오. 틀니 베이스 수지를 희석시켜 점도를 감소시켜 어플리케이터로 닿기 어려운 충치를 채울 수 있습니다. 창 위에 절연 고무 테이프를 부드럽게 놓고 동물 밴딩으로 인한 오염으로부터 창을 보호합니다.
빠른 녹색 염료 스톡 솔루션을 바이러스 용액에 추가하여 PCR 튜브에서 1~ 9의 비율로 원하는 티터로 희석합니다. 바이러스 용액의 600 나노 리터를 철회하고 더미 캐뉼라를 제거하고 내부 캐뉼라를 삽입하여 유도칸룰라에 주입 주사기에 연결합니다. 분당 15 나노 리터의 속도로 바이러스를 주입하여 총 10 분 동안 주입하십시오.
바이러스가 창 아래에 퍼질 수 있도록 내부 캐뉼라를 10분 동안 연결상태로 유지합니다. 가이드 캐뉼라에서 내부 캐뉼라를 부드럽게 제거하고 더미 캐뉼라로 다시 보냅니다. 마우스를 4%의 이소플루란으로 몇 분 동안 유도합니다.
헤드 플레이트를 헤드 포크에 고정한 다음 머리 포크를 러닝머신에 고정합니다. 낮은 배율 목표 렌즈를 사용하여 기능성 이미징을 위한 뷰를 필터링할 수 있는 최상의 렌즈를 찾습니다. 그런 다음 더 높은 객관적렌즈로 전환하여 단일 세포 해상도에서 신경 활동을 기록합니다.
칼슘 이미징의 경우, 표준 GFP 필터 감각을 사용하여 시판되는 470 나노미터 LED에 의해 녹색 형광이 흥분되었습니다. 형광 흔적을 얻기 위해, 뉴런 세포 질량에 대응하는 관심 영역을 수동으로 분할하고 ImageJ 소프트웨어에 의해 분석하였다. 40 X 렌즈 광학 전압 레코딩을 이용한 전압 이미징의 경우 830 Hertz 획득 율로 근적외선 채널에서 수행되었다.
자발적인 신경 활동 기록은 최대 25, 000 프레임동안 지속적으로 지속되었습니다. 여기서, 우리는 마우스를 행동하는 A1 영역으로서 해마의 장기 화상 진찰을 위한 방법을 기술합니다. 이 방법은 만성 이식에 기초한다.
이제 맞춤형 이미징 창으로, 또한 관심의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물의 표적 투여를 가능하게. 우리는 기술된 프로토콜이 간단하고 적당한 1 광자 화상 진찰 설정을 사용하여 마우스를 행동하는 마우스의 해마에 있는 높은 공간 측두성 해상도를 가진 신경 활동을 조사하는 것을 목표로 하는 연구를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.
