캡처 효율과 동적 라이브 셀 이미지 관찰을 효과적으로 결합하여 세포 상호 작용이 세포 행동에 미치는 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 이 튜브는 더 큰 챔버에서 여러 단일 세포를 매우 효율적으로 캡처할 수 있으며, 다중 단일 세포 상호 작용 동작을 동적으로 추적하기 위한 충분한 배양 기반을 제공할 수 있습니다. 먼저 PDMS 장치를 준비합니다.
웨이퍼 몰드를 100마이크로리터의 트리클로로실레인을 건조기에 놓고 15분간 진공청소기를 발라주세요. 진공을 멈추고 건조기에서 웨이퍼 몰드를 섭씨 37도에서 최소 한 시간 동안 살리시게 하십시오. PDMS 베이스와 PDMS 경화제를 10대 1의 비율로 혼합한 다음, 15센티미터 접시에 웨이퍼 몰드에 총 20그램의 혼합물을 붓습니다.
15센티미터 의 접시를 건조기에 넣고 1분 반 동안 진공을 가드합니다. 그런 다음 건조기에서 접시를 제거하고 질소 가스로 PDMS의 잔류 기포를 제거합니다. 접시를 오븐에 넣고 2~4시간 동안 65도의 오븐에 놓아 PDMS를 치료합니다.
완료되면 웨이퍼 금형에서 PDMS 복제본을 제거하고 1.5mm 입구와 PDMS의 0.5밀리미터 콘센트를 펀치합니다. 분리형 테이프로 PDMS 복제본과 슬라이드 표면을 청소합니다. 산소 플라즈마로 표면을 치료합니다.
그런 다음 PDMS 복제본을 슬라이드와 수동으로 정렬하여 서로 접촉하게 합니다. 하루 동안 65도 의 온도 오븐에 PDMS 슬라이드를 둡니다. 다음 날, PBS로 채워진 컨테이너에 PDMS 장치를 침지합니다.
건조기에 넣고 15분 동안 진공을 바르습니다. 장치를 세포 배양 후드로 이동하여 30 분 동안 UV 빛으로 살균하십시오. PDMS 장치 버퍼를 중간 크기로 교체하고 하루 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.
세포가 70~80%의 인플루언서를 달성하면 배양 배지를 제거하고 PBS의 5밀리리터로 세 번 부드럽게 세척합니다. WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포에 1개의 마이크로몰러 형광염을 포함하는 DMEM/F-12 배지의 1밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 멸균 PBS의 5 밀리리터로 세포를 세 번 부드럽게 씻고, PBS를 제거하고, 0.25%의 트립신-EDTA의 2밀리리터를 추가합니다.
실온에서 4분 동안 세포를 배양한 다음 배양 접시를 부드럽게 탭하여 세포 분리를 촉진합니다. DMEM/F-12 배지 4밀리리터를 추가하여 WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포를 분산시키고 세포를 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 3분 동안 300xg으로 분산시합니다. 상체를 제거하고 DMEM/F-12 배지의 1밀리리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다.
밀리리터당 3회에서 5번째 세포의 농도로 세포 현탁액 1밀리리터를 준비하고 세포 응집을 방지하기 위해 얼음위에 보관하십시오. 장치의 콘센트와 주사기 펌프 사이에 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 연결합니다. 매체를 제거하고 준비된 셀 서스펜션의 마이크로리터 1개를 PDMS 장치의 입구에 넣습니다.
다음으로, 분당 0.3 마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프를 사용하여 셀 서스펜션을 장치에 적재한다. DMEM/F-12 배지 의 마이크로리터 를 장치의 입구에 추가한 다음 주사기 펌프를 사용하여 매체를 장치에 로드합니다. DMEM/F12 배지의 0.3 마이크로리터를 분당 10마이크로리터의 유속으로 주사기 펌프로 장치에 적재한다.
셀을 적재한 후 튜브를 제거하고 폴리올레핀 테이프로 입구와 콘센트를 밀봉하여 폐쇄배양 시스템을 만듭니다. PDMS 장치를 10센티미터 배양 접시로 이동하고 매체의 증발을 피하기 위해 장치 주위에 멸균 PBS 10 밀리리터를 추가합니다. 배양 접시를 3배의 단일 세포 배양을 위한 인큐베이터로 옮기.
PDMS 장치에는 배양 챔버 및 바이패스 채널에 연결하는 캡처 사이트가 있는 3층 구조가 있습니다. 배양 챔버와 바이패스 채널 간의 유동 저항의 차이로 셀이 캡처 위치로 흐르게 되어 다음 셀이 우회 채널을 거쳐 다음 캡처 사이트로 이동하게 됩니다. 역류 단계는 포획 부위에서 세포를 방출하고 배양 챔버로 전송하는 데 사용됩니다.
이 프로토콜의 세포 포획 효율은 세 가지 상이한 세포 유형에 대해 평가되었다. 인간 림프내피 세포, 또는 LEC, 인간 구강 편평상피 세포 암 T2.6 세포는 WNT5B 특이적 짧은 헤어핀 RNA및 pLKO-GFP 벡터 제어 세포를 발현한다. 3개의 입증된 세포의 단세포 포획 효율은 LECs의 약 71%, WNT5B sh4 세포에 대한 74%, pLKO-GFP 세포에 대한 78%였다.
상기 삼중 단세포 포획 효율은 48%로 림프 내피 세포 및 편평암세포의 다중 단일세포 공동 배양에 사용될 수 있고, 세포의 증식 및 형태학은 현미경으로 관찰될 수 있다. 셀 응집체가 단일 페어링 효율을 감소시킬 뿐만 아니라 마이크로 채널을 막을 수 있기 때문에 준비된 셀 서스펜션에 최소한의 셀 응집체가 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 개별 적인 세포 사이 세포 세포 상호 작용 세포 행동을 통제에 중요 한 역할을.
우리의 방법은 연구원이 인구 기지를 둔 연구 결과에서 쉽게 얻을 수 없는 새로운 기계장치의 발견으로 이끌어 낼 수 있는 단 하나 세포 수준에서 세포 상호 작용을 공부하는 것을 돕기 위하여 효율적인 공구를 제공할 수 있습니다.
