우리가 진화 가속기를 호출이 미세 유체 암 온 칩 모델은 단일 세포 수준에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기, 실시간 정량적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 우리가 종양과 같은 스트레스 풍경 하에서 암의 진화역학을 탐구할 수 있게 합니다. 형태, 인구, 운동성 및 셀룰러 수준에서 시간이 지남에 따라 마이그레이션을 포함한 정보를 제공합니다.
잘 통제된 응력 그라데이션 하에서 혼합 종양 집단의 행동을 통제하고 감시하는 기능을 통해 우리의 기술은 전임상 약물 개발을 위한 생리학적으로 관련된 모델을 제시할 수 있습니다. 제시된 압력 밀봉 포장 방법은 또한 주변 가스 조성및 다운스트림 실험 용량의 정교한 조정을 요구하는 다른 미세 유체 시스템에서 구현될 수 있다. 장기적인 실험을 성공적으로 수행하는 열쇠는 신체적, 생화학적으로 안정적인 환경을 확보하는 것입니다.
온도, 습도 및 가스 구성을 포함한 요인을 항상 모니터링해야 합니다. 먼저 3D 프린팅 머신에서 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 스크류 드라이버로 사용자 정의 세 개의 잘 샘플 플레이트의 구성 요소를 풀수 있습니다.
적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 성분을 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 셀주 파종을 시작하려면 10센티미터 배양 접시에 각 PC3-Epi 또는 PC3-EMT 세포 배양에 5밀리리터의 트립신을 추가하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 5분 동안 트립시니화를 실행한다. 배양 접시에서 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 150배 g에서 3분간 전달합니다.
상부체를 폐기합니다. 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈전계를 사용하여 각 PC3-MP 또는 PC3-EMT의 세포를 계산합니다. 각 세포 유형의 4개에 총 2.5배 10배를 분리한다.
두 개의 분리된 세포 유형을 혼합하고 배양 매체의 2밀리리터에 추가합니다. 세포 배양의 2밀리리터를 각각 3개의 가스 투과성 배양 접시에 넣습니다. 세포가 부착할 수 있도록 밤에 37도섭씨에서 인큐베이터에 투과성 가스를 남깁니다.
적어도 1시간 동안 자외선 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 이제 이산화탄소와 산소 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 3세트 및 압력 게이지로 구성된 가스 공급 시스템을 구축했습니다. 또는 노목시아 조건을 제공하는 가스 공급 시스템을 사용하십시오.
혼합 챔버의 상대 습도가 85% 이상으로 증가하여 뚜껑과 하단 플레이트에 대해 별도의 가열 서브 유닛을 37도에 배치하십시오. 다음 날 인큐베이터에서 가스 투과성 배양 접시를 꺼내 상세한 구성 요소가 순서대로 되어 있음을 파악하고, 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35 밀리리터 와이드 유리 창을 보유하고 있습니다. 장착 된 나사를 사용하여 이러한 구성 요소를 조립하고 가스 투과성 문화 접시를 고정하십시오.
그런 다음 미리 따뜻워진 배양 매체를 진공 챔버로 이송하여 20분 동안 가스를 디가스로 옮김시합니다. 친성 유지를 위해 산소 플라즈마 시스템에서 PDMS 칩을 30초 동안 치료합니다. 다음 로드 두 주사기와 천천히 로드 2 주사기 10 탈 가스 성장 미디어의 밀리리터와 다른 두 주사기와 10 디가스 드 가스 원하는 관심의 시약.
예를 들어 약물이 있는 미디어 및 미디어. 각 각 주사기를 50센티미터 튜브에 연결하여 23 게이지 디스펜싱 바늘을 하나의 중공 강철 핀에 넣습니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입합니다.
튜브에 미디어를 밀어 튜브를 프라임하 고 캡핑 층을 통해 각 PDMS 칩에 강철 핀을 삽입합니다. 저장소 레이어를 채우고 PDMS 패턴 레이어를 미디어로 적시습니다. 저수지 층은 기포가 미세 유체 패턴으로 유입되는 것을 방지하기 위해 온 칩 버블 트랩으로 작동합니다.
그런 다음 문화 매체와 함께 밀리리터 주사기를 1개로드합니다. 주사기를 5센티미터 튜브에 연결하여 23 게이지 디스펜싱 바늘을 하나의 중공 강철 핀에 넣습니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입하고 튜브를 프라임합니다.
칩의 중앙 구멍에 중공 스틸 핀을 삽입하여 나중에 과도한 매체를 추출합니다. 전방 데크에 칩 당 2개의 10 밀리리터 주사기를 로드하고 다른 두 주사기를 주사기 시스템의 인출 덱에 놓습니다. 미세 유체 패턴에 마이크로 버블을 포획하지 않도록하기 위해, 35 밀리리터 심층 가스 투과성 배양 접시에 사전 따뜻하게 및 탈가스 매체의 1 밀리리터를 분배합니다.
칩이 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근하는 가스 투과성 배양 멤브레인 위에 칩을 직접 배치합니다. PDMS 칩 홀더로 PDMS 칩을 고정하여 PDMS 장치를 아래로 밀어 붙입니다. 칩이 건조되는 것을 방지하기 위해 PDMS 장치 위에 실러 시트를 테이프로 고정하고 PDMS 칩 홀더로 클램프합니다.
어레이 주위의 미디어 유량은 시간당 20마이크로리터로 설정합니다. 반전 된 현미경의 전동 단계에 무대 인큐베이터에 전체 플레이트를 배치합니다. 가스 튜브를 통해 가스 공급 시스템을 가스 채널에 연결하고 게이지 압력을 0.2 PSI로 유지합니다.
이를 통해 설치된 PDMS 칩에 대한 가스 투과성 배양 멤브레인을 가압하여 장치의 밀봉을 보장합니다. 중앙 구멍에서 밀리리터 주사기를 사용하여 칩에 과도한 미디어를 천천히 추출합니다. 미디어를 추출하는 동안 현미경 아래칩을 관찰한 다음 칩이 밀봉될 때 추출을 중지합니다.
무대 위 인큐베이터의 온도 감지 장치를 세 개의 웰 플레이트에 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 이 연구에서 PC3는 외부 스트레스의 존재없이 진화 가속기에서 배양하면서 성장 곡선을 했다. 칩 을 가로 질러 위치의 함수로 세포 증식 프로파일의 동일성을 제안.
곡선의 초기 경사는 확산 속도를 보여줍니다. 장치의 셀에 대한 두 배의 시간은 약 24 시간입니다. PC3-EMT및 mCherry발현PC3-EMT 및 mCherry 발현 PC3-에피 세포 줄 지어 진화 가속기에서 공동 배양되었다.
40%의 합류부터 3일 만에 40%의 컨할수 있는 성장률을 기록했다. 총 합류의 성장 곡선은 물류 성장 모델의 형태입니다. PC3-EMT의 인구는 계속 확장되었고 PC3-Epi는 점막 단계에서 억제되었습니다.
PC3-Epi 및 PC3-EMT 셀은 장치의 중앙에 조밀하게 앉아 빈 영역으로 자유롭게 이동할 수 있었습니다. 두 표현형의 속도의 정규화된 히스토그램은 PC3-EMT의 속도가 1.8배 인 PC3-Epi보다 현저히 높았다는 것을 보여준다. 문화 매체를 미리 데우고 가스를 해제해야 하는 동안 모든 비용으로 마이크로 버블을 만드는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다.
PDMS 칩을 제대로 적시고 부드럽게 처리해야합니다. 우리의 압력 밀봉 방법의 부드러운 재 밀봉 특성으로 인해 많은 다운 스트림 실험을 미리 형성 할 수 있습니다. 전임상 인구 추출, 국소 대사산물 분석, 공간적으로 해결된 면역형광 및 시퀀싱과 같은.
당사의 기술은 복잡한 초마이크로 환경에서 포괄적인 방식으로 주요 구성 요소와 상호 작용을 재현하는 방법을 보여줍니다. 그러나 정량적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 데이터를 제공할 수 있을 만큼 간단합니다.
