이 작품은 SST에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A_135278)에서 교부금에 의해 지원되었다. MOP는 AXA 연구 기금 박사 보조금의 수혜자입니다. 우리는 그림 1의 디자인에 대한 도움말은 패트리샤 Nigg 감사합니다.

전에 시작 주 : 사용 층류 후드 및 적절한 biocontainment을 라이브 바이러스에 작업 할 때. 여기서는 배양 인플루엔자 바이러스 균주 A / WSN / 33에 적합한 성장 조건을 설명한다. 감염의 다중성 (MOI)와 배양 시간은 사용 바이러스 균주에 따라 달라질 수 있습니다. 바이오틴 / WSN / 33 바이러스의 1. 준비 <ol><li> 시드 Madin-다비 송곳니 kindey (MDCK), 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용하여 2 cm의 T175 플라스크에 세포. 약 70 %의 전면 생장까지 37 ℃에서 배양 된 세포로 진행한다. </li><li> 감염 전에 배지 제거하고 세포 단층을 덮도록 충분한 양을 첨가하여 인산염 완충 식염수 (PBS, pH7.0-7.3)으로 세포를 세척 하였다. </li><li> PBS를 제거하고 10-4의 방어와 A / WSN / 33 세포를 감염. PBS에 바이러스를 희석은 0.02 mg의 마그네슘 2+, 0.01 mg의 칼슘 2 + &lt;보충/ SUP&gt;, 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 펜 / 스트렙토 (감염-PBS). T175의 CM 2 플라스크 4 ml로 접종을 사용합니다. </li><li> 세포를 37 ℃에서 1 시간을 품어. 플라스크에 0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 펜 / 연쇄상 구균 보충 열망과 피펫 (10)의 ML의 DMEM에 의해 접종을 제거합니다. </li><li> 다음 수확 뜨는 볼 수 있으며, 세포 변성 효과 (CPE)까지 약 3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품어. CPE는 분리 셀 (14)의 죽음 뒤에 세포의 반올림으로 인식 될 수있다. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 5 분 동안 450 XG에 뜨는 스핀. 새로운 팔콘 튜브에 뜨는을 전송하고이 단계를 한 번 더 반복한다. 알약을 폐기하십시오. </li><li> 초 원심 분리기 튜브 및 NTE 완충액 (10 mM 트리스 [pH 7.4의, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)에 희석 30 % 수크로오스 5 ㎖와 언더 상청액에 넣고 상청액. 초 원심 분리하기 전에 튜브 균형 및 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 채워. 스핀 superna112,398 XG에 tants은 초 원심 분리기 90 분 (SW28 로터 25,000 RPM에 해당). </li><li> 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS에 4 ℃에서 하룻밤 바이러스 펠렛을 흡수. 로 pipetting 아래로 재현 탁 펠렛. 브래드 포드 분석에 의해 정제하여 15 바이러스의 단백질 함량을 측정한다. </li><li> 비오틴은 / WSN / 33을 생성하는 바이오 틸 키트를 사용합니다. 제조업체의 지시를 따르십시오. </li><li> 간단히, 정제 된 바이러스에 비오틴을 적당량 추가하고 얼음에 2 시간 동안 배양한다. 초 원심 분리기 튜브에 바이러스를 옮기고 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 관을 채운다. 초 원심 분리기에서 90 분 동안 112,389 XG에 바이러스를 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 밤새 펠렛을 만끽 해보세요. 분취 량은 최소 24 개월 동안 안정 할 것이다 -80 ° C에 보관 비오틴 바이러스를 저장. 참고 :이 바이오틴 (P)의 역가를 결정하는 데 도움이 될 수표준 상패 분석​​에 의해 IAV의 배상. 그러나, 후속 프로토콜 만 비오틴 바이러스 입자를 측정하는 것을 유의해야한다. 불완전한 바이오 틸 unbiotinylated 입자에 남은 플라크 분석으로 아니라 첨부 / 내재화 분석에서 측정 된 신호에 전염성 역가에 기여할 것이다. </li></ol> 2. 바이오틴 바이러스의 필요한 양을 결정 주 : 부착 / 내재화 분석이 수행되기 전에, 그 시료의 모든 세포를 감염시킬 필요 비오틴 바이러스의 양을 결정하는 것이 중요하다. <ol><li> 문화 및 제조자의 지시에 따라 세포를 Trypsinize A549. 셀 챔버를 사용하여 세포를 카운트. FACS 피펫 200,000 A549 세포 튜브 deepwell. 스핀 450 X g에서 3 분. 200 μL PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 쿨 세포 아래로 얼음에 10 분 동안. </li><li> bioti의 5 배 연속 희석을 준비감염 PBS에서 nylated 바이러스 재고. </li><li> 450 x g에서 3 분 동안 4 ℃에서 세포를 포함하는 스핀 튜브. 100 μL 바이러스 함유 감염 PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 바이오틴 바이러스없이 모의 제어 사용 감염 PBS로. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 고정 용, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 투과성으로 들어, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 0.5 % 트리톤 X-100을 포함하는 100 μl의 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 6 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거PBS가 STV-Cy3에 함유 희석 50 μL, 2 %의 BSA 등. (참고, STV-Cy3에 적절한 농도는 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다 (1)의 농도로 시작합니다. 배 2 희석 최대 1 200 시험 :. 2400 우리의 손에, 1의 희석 : 입증 1,000 최적합니다.) </li><li> 실온에서 어둠 속에서 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에서 설명하지만 PBS에 희석 200 μL 2 % BSA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 16 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. Cy3에 양성 인구에 문입니다. A549 인구를 Cy3 양성 세포의 최대 수의 결과 비오틴 화 바이러스의 최저 농도를 선택한다. </li></ol> 3. 스트렙 타비 딘의 필수 양을 결정 주 : 세포 바이러스로부터 유래 된 차단 신호의 효율 분석의 검출 범위를 결정한다. 따라서, 가능한 한 많이 STV-Cy3에 신호를 폐지하는 것이 중요하다. 목STV의 필요량이 필요 전자는 (섹션 2에서 결정)를 사용 바이오틴 바이러스 주식의 양에 따라 달라집니다. <ol><li> 단계 2.1-2.4를 수행하지만, 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용합니다. </li><li> PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 STV의 5 배 희석액을 준비한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 50 μL STV 희석에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 모의 제어 사용함없이 PBS STV는 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유. 얼음에 30 분 동안 튜브를 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. </li><li> 단계 2.5-2.9를 수행합니다. 국제화 분석의 경우, (더 STV가 존재하지 않는에서 샘플에 비해)를 Cy3 신호의 강력한 블록의 결과 STV의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 이를 위해, CY3 양성 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. 이상적 STV - 처리 샘플의 신호를 Cy3 모의 감염된로부터의 신호에 가까워 야가능한 세포. </li></ol> 4. 첨부 파일 / 내면화 분석 참고 : 분석을 시작하기 전에 모든 시약을 준비해야합니다. 프로토콜에 대한 세 가지 제어 결과 섹션 (모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 사전 처리 된 세포 및 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포)에 제시된 그룹 작은 변화가 필요합니다. <ol><li> 각각 200,000 A549 세포를 함유하는 16 deepwell 튜브를 준비한다. 다음 4 관으로 구성된 실험 세트, 3 제어 조건, 각각의 요구 4 튜브가 : 모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 (NA) -pretreated 세포와 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포. 각 그룹은 &#39;0 분&#39;, &#39;0 분 + STV&#39;, &#39;30 분 &#39;, &#39;30 분 + STV&#39;로 표시 4 관으로 구성되어 있습니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 450 X g에서 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (배양 배지)을 함유하는 200 ㎕의 DMEM에서 등. 37 ℃에서 30 분 동안 품어. 주 : 사용 세균 뉴 라미니다 아제 (시알 리다 아제 예 비브리오 콜레라부터) ml의 세포를 재현 탁하는 배양 배지에서 희석 / 200 무 농도 : 뉴 라미 제어 옵션. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 아래로 그리고,이 단계 시원한 튜브를 한 번 더 반복한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. (감염 PBS에 희석 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용) 바이러스를 비오틴 100 μL에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음에 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. 참고 : 사용하여 감염 PBS 바이러스없이 : 모의에 감염된 제어하십시오. 아 지드 화 나트륨 컨트롤 : 감염 PBS에 희석 사용 바이러스 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> 찬성얼음에 감염 후 샘플의 cessing : <ol><li> 다른 샘플이 고정 될 때까지 &#39;0 분&#39;샘플은 4 ℃에서 단계 2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 0 분 + STV &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 &#39;30 분 &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> &#39;30 분 + STV &#39;샘플 450 x g에서 3 분 동안 4 ° C에서 튜브를 회전. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 그런 다음, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li></ol></li><li> 단계 2.6-2.8에 따라 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 각 샘플에 Cy3에 양성 세포의 비율을 결정한다. </li><li> 비율 부착 바이러스 및 내면화 바이러스의 상대적인 양을 계산합니다. <ol><li> 첨부 된 바이러스의 양을 계산하기 위해,는 Cy3-positi의 비율을 사용하여게이트 된 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도를했습니다. 비교를 위해, 100 % (그림 4B)에 처리되지 않은 세포를 설정합니다. 참고 : 첨부 된 바이러스의 비율이 &quot;0 분&quot;샘플에 의해 설명되어 있습니다. </li><li> 내재화 된 바이러스의 양을 계산하기 위해, &quot;30 분&quot;의 샘플 (도 5B)에 「30 분 + STV &quot;시료의 비율을 취. 주의 : 전술 한 바와 같이, 양의 게이트를 Cy3 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

우리의 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 바이러스 첨부 파일 및 내재화를 측정하는 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 사용에 비해 더 가깝게 모방하는 바이러스 감염 표지 야생형 바이러스의 사용을 허용한다. 우리 프로토콜 IAV의 부착 및 내재화를 측정하는 데 최적화되어 있지만 이는 다른 바이러스를 쉽게 적용 할 수있다. 유동 세포 계측법은 판독에 사용되는 바와 ...

인플루엔자 바이러스 (IAV)의 엔트리 (1) 표적 세포의 세포막 수용체에 바이러스의 결합으로 시작 다단계 공정이다. IAV의 수용체는 당 단백질과 당지질의 큰 다양성에 존재하는 시알 산이다. 바이러스 엔벨로프에 존재 IAV의 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질은 시알 산에 결합함으로써 표적 세포 (2)의 세포막에 바이러스 입자의 부착을 매개한다. 바이러스는 3-6 설명되었다 클라 트린 매개 엔도 시토 시스를 통하여 세포뿐만 아니라, macropinocytosis 같은 대체 입력 경로를 들어간다. HA 및 시알 산 사이의 상호 작용은 모두 중재 첨부 파일 및 바이러스 입자 (7)의 내재화를 유발하기에 충분한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 엔트리 수용체가 제안되었으며, IAV 항목의 역할은 현재 1,8,9을 연구되고있다. 똥개다발 적 노력 시급 신규 항 바이러스 요법 10-12을 개발 목표로 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 숙주 요인을 파악하게된다. 바이러스 엔트리는 그 최초의 지점에서 바이러스 감염을 차단하기 위해 IAV 성장 타겟팅 유리한 공정이 될 것이다. 바이러스 보통 다량 들어오는 바이러스를 검출하는 데 필요한대로 IAV 항목의 여러 단계를 측정하는 것은 실험적으로 도전. 또한, 바이러스 엔트리의 변화를 검출 범위 인해 바이러스 복제의 부족 만 선형이다. 이것은 고감도 분석에 대한 필요성을 강조한다. 우리는 여기에 제시 분석은 세포 - 관련 바이러스의 총량에 대해서, 세포 표면에 부착 된 바이러스의 검출뿐만 아니라 내면화 바이러스 검출 할 수있다. 비오틴 야생형 바이러스의 사용은 유동 세포 계측법에 의해 STV-Cy3에있는 염색 및 판독을 통해 편리하게 측정 할 수있다. 바이오틴 바이러스는 세포에 냉간 바인딩S는 첨부 파일을 허용하지만, 바이러스 입자의 국제화를 방지합니다. 세포를 고정 및 투과 화 바이러스 부착을 측정하는 STV-Cy3에 염색 할 수있다. 블로킹 단계는 세포가 비 - 표지 된 스트렙 타비 딘 (STV)와 함께 배양 된 정착 전에 적용하는 경우 외, 첨부 된 비리 온으로부터 신호가 폐기 될 수있다. 다음 단계에서, 바이오틴 IAV 부착 다음, 온도는 37 ° C로 시프트하고, 바이러스 입자의 내재화가 일어나는 것이 허용된다. 내면화 입자함으로써 외의의 뜻과 세포 내 바이러스 사이의 차별을 허용하는 STV의 결합으로부터 보호됩니다. 실험 조건 당 4 개의 샘플이 필요한 &#39;0 분&#39;첫번째 샘플, 표지 된 &#39;0 분&#39;, 세포 표면에 결합 된 초기 바이러스를 측정하는 방법이다. &#39;0 분 + STV&#39;: 제 2 샘플, &#39;0 분 + STV&#39;표시는, 실험의 기준 신호 강도를 제공한다. 첨부 된 바이러스는 재치 차단시간 STV와 STV-를 Cy3와 신호 다음 염색 &#39;0 분&#39;샘플에 비해 훨씬 낮은해야합니다. &#39;30 분 &#39;세 번째 샘플, &#39;30 분&#39;이 때문에 30 분 동안 37 ° C의 온도 변화에 부착 바이러스를 내면화 포함되어 있습니다. &#39;30 분 + STV &#39;네 번째 샘플, &#39;30 분 + STV&#39;조치 바이러스의 세포 내 부분. STV 차단 단계는 30 분 잠복기 후에 적용됩니다. 결과적으로, 세포 표면에 바이러스 입자가 STV-Cy3에 염색 만 내재화 바이러스 가능한 이탈 STV에 구속된다. 내재화 바이러스의 상대적인 양은 &#39;(샘플 &#39;30 분 설명) 바이러스의 총량으로 나눈 값 (샘플 &#39;30 분 + STV 측정)&#39;내재화 바이러스의 비율로 계산 될 수있다. 컨트롤로서 우리는 모의 감염된 세포를 포함하는 것이 좋습니다. 모의 - 감염된 세포의 STV-Cy3에 염색 다음 신호는 배경을 준다염색 프로토콜의 결과. IAV 부착용 제어 세균 뉴 라미니다 제 (NA)와 세포의 전처리이다. 세포 당 단백질의 시알 산 오프 NA 클리브는함으로써 세포 표면 수용체에서 부착을 제거하는 단계를 포함한다. 아 지드 화 나트륨 (SA)의 강력한 억제제 인 대사시켜 블록 (13)은 세포 내 이입. 아 지드 화 나트륨으로 처리 된 세포는 국제화를위한 바인딩 바이러스 양성하지만 부정적인해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

네 개의 다른 실험 조건을 나타내는 만화는도 1에 도시되는 대표적인 실험의 결과는도 2에 제시된다 -. 5. &quot;0 분&quot;샘플에서 바이오틴 바이러스 초기 바인딩 된 STV-Cy3에 염색으로 가시화 될 수있는 세포를 대상으로 (도 1 및도 2). ( &quot;0 분 + STV&quot;샘플에서) 차단하는 단계가 적용되는 경우, 세포 표면에서 바이러스가 더 이상 STV-Cy3에 염색에 ?...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

비디오: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.