This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.

BOEC 세대 프로토콜의 개략도는도 1에 도시된다. 1. 혈액 수집 및 밀도 구배 원심 분리 <ol><li> 각 공여체 개의 50 ㎖ 원뿔형 원심 분리 관 각각에 시트르산 나트륨 3 ㎖를 추가한다. 정맥 천자에 의해 혈액 60ml를 수집하고 각 튜브에 30 ㎖를 추가합니다. 혼합 가볍게 2 ~ 3 회 전환. 적절하게 조정 구연산 볼륨과, 프로토콜에서 혈액의 적은 40 mL로 사용합니다. 주 : 혈액 샘플을 수집 2 시간 내에 처리하는 것이 필수적이다. 가지 식민지 수율의 현저한 감소 혈액 결과의 처리를 지연. </li><li> 제 병을 섞어 수회 반전시켜 밀도 구배 원심 분리 배지를 함유하는 새로운 원추형 튜브를 준비한다. 무균 후드에서, 50 mL의 원뿔형 튜브 (혈액의 매 10 ㎖, 도너 당 6 튜브를 튜브 1) 밀도 구배 원심 분리 배지를 가하여 15. </li><li> 둘 베코의 인산염과 1 : 1의 혈액을 희석-Buffered 식염수 (DPBS). 작업 표면과 20 °의 각도에 밀도 구배 원심 분리 배지를 함유하는 튜브를 기울인다. 피펫 보조제 및 25 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 천천히 서서히 기울어 진 관의 벽 아래로 혈액을 추가하여 매체의 상부에 희석 된 혈액의 21 mL의 층을 포함한다. 주 : 이렇게하면 농도 구배 층을 갖는 혈액의 혼합을 최소화하고 엄격한 버피 코트뿐만 아니라, 향상된 수율을 생성한다. </li><li> 35 가속기와 실온에서 분 브레이크 오프 400 XG에 원심 분리기 샘플. </li><li> 2.4 - 원심이 기간 동안, 단계 2.1에 상세히 콜라겐 코팅을 시작한다. 다음 단계는 3.1 단계로 진행하기 전에 완료했는지 확인하십시오. </li></ol> T-75 플라스크와 문화 매체의 준비 2. 콜라겐 코팅 주 : 세포 배양 후드에서 다음 단계를 수행. <ol><li> 재고 타이를 희석하여 50 μg의 / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비. 내가 0.02M 아세트산 예 10ml에 콜라겐 퍼가기 : 콜라겐 주식 4.05 밀리그램의 농도 / ㎖, 0.02 M 초산 10 ㎖에 콜라겐 123.5 μL를 추가합니다. 살균 필터 콜라겐 현탁액, 사용 전에. </li><li> 혈청 피펫을 사용하여, T-75 세포 배양 물 플라스크에 콜라겐 용액 7.5 mL를 추가. 이 볼륨은 5 μg의 콜라겐 / ㎠ (또는 375 μg의 / 플라스크)를 제공합니다. 실온에서 1 시간 동안 코트 플라스크. </li><li> 제조업체에서 제공하는 성장 인자로 보충 내피 기초 배지를 보충하여 BOEC 생성에 사용 내피 성장 배지를 준비한다. 모든 보충제를 추가,하지만 혈청을 추가하지 마십시오. , BOEC 생성 배지 15 ml를 준비하는 성장 인자를 함유 보충제 내피 성장 배지의 12.5 ml의 정의 된 태아 소 혈청 (FBS) 2.5 mL를 추가한다. </li><li> , 1 시간 코팅 기간이 지난 후에 제 3 절에서 설명하는 단계를 진행합니다 콜라겐 솔루션을 기음과 피펫 팅에 의해 잔류 아세트산을 씻어10 ML의 DPBS에. DPBS 대기음과 한 번 더이 세척 단계를 반복합니다. 단계 3.3 중에 얻어진 세포 현탁액이 때 도금 준비되지 않은 경우, 건조 아웃에서 콜라겐 코팅을 유지하는 플라스크 BOEC 생성 5ml의 배지를 추가한다. </li></ol> 3. 수집 및 PBMNCs의 도금 <ol><li> 단계 1.4에서 설명하는 밀도 구배 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 버피 코트 층을 수집한다. 버피 코트의 컬렉션은 각 관에서 세포 현탁액과 혈장의 약 20 ㎖를 산출한다. 밀도 구배 매체를 전송하는 피. </li><li> 단핵 세포 현탁액을 희석 1 : 1, DPBS 혼합 반전. 최대 브레이크와 액셀러레이터 300 XG에 20 분 동안 실온에서 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 아래마다 반복 펠릿 BOEC 생성 배지 1 ㎖를 첨가하고, 피펫 팅에 의해 위로 뜨는 재현 탁하고 세포를 흡인. 풀 세포 현탁액을나머지 중 10 ml의에 D 상단까지 총 부피. </li><li> 총 세포 수, 시료 세포 현탁액 10 μL의 추정을 얻고 적혈구 용균 것이다 터크의 용액 490 μL, 50X와 희석. 혈구 계를 사용하여 희석하여 세포 현탁액 10 μL 샘플을 계산. 참고 : 60 ㎖의 혈액이 도금 약 100-150 × 106 백혈구를 수득한다. </li><li> 단, 콜라겐 코팅 된 T-75 플라스크에 플레이트 전체 세포 현탁액을, 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기에서 37 ℃에서 15 ㎖ / 플라스크 배양 위에서 업 매체 볼륨. 이 시간에 도금 세포 통로 0을 나타냅니다. 주 : 나중에 또는 BOECs가 생성 될 수있다 다른 실험실로 수송 PBMNCs 위해 BOECs을 유도하기 위해 이전에 분리 BOEC 절연 PBMNCs을 동결시킬 수있다. 그러나,이 냉동 PBMNCs BOEC 분리의 효율을 감소시킬 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 에스방법은 아래 EE (8). </li></ol> 4. 장기 세포 배양 <ol><li> 신선한 BOEC 생성 배지 15 mL를 첨가하여 2 일마다 배지 변경 (5 : 내피 세포 성장 배지 1 혼합물을 FBS 및 정의). 주말의 경우, 매체의 변화는 매 3 일 지연 될 수 있습니다. 참고 : 파생물 식민지 문화의 7 14 일 사이에 나타납니다. </li><li> 가지 식민지의 모양에 대한 일 7-14에 BOEC 문화 플라스크를 모니터링합니다. 고전 내피 조약돌 형태를 나타내는 세포의 원형 그룹과 같은 식민지를 식별합니다. </li><li> 식민지 또는 다수의 식민지가 플라스크에서 확인되면, 매체의 변화를 계속하고 식민지 계대 전에 식민지 당 약 1000에서 2000 사이 세포로 성장할 수 있습니다. 대략적인 시각적 평가를 통해 식민지 당 세포 수를 결정합니다. 참고 : 가이드로서, 1 주일 먼저 가지 식민지의 확인 후 통과 초기 가지 식민지에 관례이다. </li> &lt;리&gt; DPBS 10 ㎖로 두 번 플라스크를 세척하여 항로 세포. 1X 트립신 EDTA 5 mL를 추가하고 5 분 동안 37 ° C 배양기에서 배양한다. 5 분 후, 배지 (FBS 함유) 10 mL로 트립신을 중화 반복 피펫 팅으로 세포 현탁액을 가져온다. </li><li> 5 분 300 XG, 신선한 BOEC 세대 매체의 15 용액에 재현 탁하고 새로운 T-75 플라스크 (대표 통로 1, P1)로 전체 세포 현탁액을 도금에서 원심 분리기 서스펜션. 어떤 콜라겐 코팅이 필요하지 않습니다. </li><li> 세포가 합류 (플라스크 당 약 3 ~ 5 × 10 6 세포)가 될 때까지 상기 한 바와 같이 매체 변화를 계속합니다. 합류 후에 세포 통로 단계 4.3에 기재된 바와 같이. 주 : 전방 통로 (2)에서, 세포는 더 이상 생성 BOEC 매체를 필요로하지 않으며 내피 세포 성장 배지 및 10 % 열 - 불 활성화 된 표준 FBS에서 배양 할 수있다. 콜라겐의 존재 BOEC prolifer을 향상시킬 수 있다는 증거가 콜라겐 코팅은 선택적인 단계 향후로서 사용될 수있다ATION 속도. </li><li> 계속 계대, 플레이트 T-75 플라스크 당 더 적은 75보다 세포의 낮은 세포 밀도는 BOECs가 확산 중지 될 수 있습니다. </li></ol> 5. 동결 융해 BOEC 문화 <ol><li> 5 분 동안 300 XG에 4.3 절과 원심 분리기에 설명 된대로 세포를 Trypsinize. 배지 10ml에 재현 탁하고 상등액을 흡인. 이것은 내피 세포 성장 배지를 필요로하지 않는다; 10 % 표준 FBS와 DMEM 충분하다. 혈구 계를 사용하여 수동 세포 수를 수행하는 세포 현탁액 10 μL 샘플을 수집한다. </li><li> 빙냉 동결 배지 (50 % FBS와 10 % DMSO 40 %의 DMEM)에 2 × 106 세포 / ㎖로 재현 탁하고 다시 원심 분리한다. 에 차가운 얼음 이소프로판올 냉동 보존 용기와 장소에 0.5 ㎖ (10 6 세포) 각 유리 병에, 장소의 병을 추가 -80 적어도 2 시간 동안 ° C의 냉동고 액체 질소로 전송하기 전에. 이상 24 시간 동안 -80 ° C에서 세포를 두지 마십시오. </lI&gt; <li> 세포를 해동 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 미리 예열 매체 10 ㎖를 추가합니다. 주 : 통로 1 세포를 해동 할 때, 해동 후 처음 2 일 동안 20 % FBS 정의 보충 내피 세포 성장 배지에 해동. 이는보다 안정적인 세포 격리 향후 리드. </li><li> 단지 작은 얼음 결정이 유리 병에 남아 때까지 교반과 함께 37 ℃로 물을 욕조에 액체 질소와 해동에서 세포를 제거합니다. 원뿔 원심 분리기 튜브에 유리 병 드롭 지혜의 내용을 추가하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운. </li><li> 10 ml의 EGM-2mV의 + 10 % FBS에서 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛. 15 ml의 T-75 플라스크 상단까지 매체에 추가합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 BOECs 6. 특성 <ol><li> 염색 버퍼 용액 당 10 6 세포의 농도로 4.4 절과 재현 탁에 설명 된대로 4 절에 설명 된 BOEC 식민지가를 Trypsinize 세포를 확장하도록 허용되고 나면 (DPBS 위트H 2 % FBS와 2 mM의 EDTA). </li><li> CD45, CD14, CD34, CD31 (사용 1시 20분 희석 모든) 또는 VEGFR2 (희석 1시 10분)에 대한 감독, 형광 - 복합 항체 (자세한 내용은 표 1 참조) 10 5 세포를 결합합니다. 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 1 ml를 5 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기를 염색 세포를 씻으십시오. 기음 뜨는 및 분석을위한 400 μL 염색 버퍼에 resuspend. 4 ° C에서 세포를 유지하고 빛의 사전 분석에 보호. </li><li> 분석에서 사용 된 형광 복합 항체를 검출하기 위해 구비 사이토에 세포 계측 분석을 수행한다. </li><li> 전방 조절 및 측면 산란 전압뿐만 아니라 FITC 및 APC 채널 전압에 의해 사이​​토 세포 집단을 식별하는 흠 BOEC 샘플을 사용한다. </li><li> 각각의 형광 색소에 대한 이소 염색 된 세포를 사용하여 임계 값을 게이팅 결정합니다. presenc에 기초하여 각각의 세포 표면 마커에 대해 양성을 평가형광 색소에 대한 이소 타입 제어 대 형광 강도의 피크 시프트의 전자 분석된다. </li></ol> 면역 형광 현미경으로 BOECs 7. 특성 <ol><li> 내피 세포 성장 매체의 500 μL에 5 × 10 4 세포의 밀도로 된 커버없이 24도, 평면 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이트 BOECs + 10 % 열 - 불 활성화 아니라 당 FBS가와 준수, 37에서 성장 떠나 ° C는 세포까지 5 % CO 2는 적어도 70-80 각각의 표면적 % 웰 (microsope 광 하에서 육안으로 추정 포화 상태) 커버. </li><li> DPBS의 1 ㎖로 5 분 동안 잘 각각의 세포를 씻으십시오. </li><li> DPBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL와 4 ° C에서 세포 O / N을 수정합니다. </li><li> 물론 당 DPBS 1 ㎖로 3 × 5 분 동안 세포를 씻으십시오. 추가 각각 펫 및 흡인기를 이용하여 DPBS를 제거합니다. </li><li> DPBS에서 0.2 % 폴리 소르 베이트 20 3 × 10 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면. </li&gt; <li> DPBS에서 10 % FBS를 함유하는 블로킹 완충액에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 4 ° CO에서 염색 세포 항체 희석액 CD34 (10 μg의 / ㎖), CD144 대항 차 항체를 함유하는 (DPBS에서 0.1 % 소 혈청 알부민)을 300 μL의 / N (1 : 300) 또는 vWF의 (1 : 250) . 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li><li> DPBS와 5 × 10 분 동안 언 바운드 일차 항체를 씻으십시오. </li><li> (: 200 1 모든) 표 1에 설명 된대로 적절한 형광 표지 된 이차 항체로 실온에서 1 시간 동안 세포를 품어. </li><li> DPBS와 5 × 10 분 동안 언 바운드 차 항체를 씻어 내십시오. </li><li> RT에서 10 분 동안의 DPBS / ㎖ 4 &#39;, 6-diamidino-2-1 μg의 페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 배양한다. </li><li> 또한 3 × 5 분 동안 DPBS와 세포를 씻으십시오. </li><li> 첨부하여 형광 여기 용 외부 광원 장착 도립 현미경을 이용하여 100 배 확대 한 이미지 셀, 및 이미지를 캡처이후 분석 오프라인 에드 디지털 카메라. </li></ol> 8. 동결 융해 PBMNCs <ol><li> 원심 다음 단계 3.2의 끝에서, 매질을 흡인하고 수동 반복 피펫 위로 및 P1000 피펫 팁을 사용하여 다운 세포 펠렛을 방해. 세포 현탁액을 제조 부드럽게 섞어 확인한 동결 배지, 90 % 혈청과 10 % DMSO 1ml를 추가하기. cryovial에 세포 현탁액을 전송하고, 동결과 제 5 절에 설명 된대로 해동. </li></ol>

<ol>
	<li>Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis,+angiogenesis,+and+growth+factors:+ephrins+enter+the+fray+at+the+border.">Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border.</a> Cell. 93, 661-664 (1998).</li><li>Flamme, I., Fr&#246;lich, T., Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+vasculogenesis+and+embryonic+angiogenesis.">Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis.</a> J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+therapeutic+actions+of+endothelial+progenitor+cells+in+pulmonary+hypertension.">Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).</li><li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis.">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+analysis+reveals+a+specific+HOX+signature+associated+with+positional+identity+of+human+endothelial+cells.">Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells.</a> PLOS ONE. 9, e91334 (2014).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+dysfunction+of+endothelial+progenitors+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+storage+and+secretion+of+von+Willebrand+factor+in+blood+outgrowth+endothelial+cells+derived+from+patients+with+von+Willebrand+disease.">Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease.</a> Blood. 121, 2762-2772 (2013).</li><li>O'Neill, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+revascularisation+of+ischaemic+tissue:+the+opportunities+and+challenges+for+therapy+using+vascular+stem/progenitor+cells.">Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Res &amp; Ther. 3, 31 (2012).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+and+Efficient+Cellular+Substrate+for+the+Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adults:+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells.">A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells.</a> Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+endothelial+colony+forming+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood.">Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+large+scale+expansion+of+adult+human+endothelial+colony+forming+progenitor+cells.">Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

최근까지, 새로운 혈관의 산후 생성은 기존의 혈관의 내피 세포에서 새로운 혈관의 발아로 정의 혈관 신생으로 알려진 과정을 통해 독점적으로 발생하는 것으로 추정 하였다. (1)이 프로세스는 혈관 형성에서 대조하거나 배아 발생 동안 배타적으로 발생하는 것으로 생각되었다 내피 전구 세포로부터 혈관의 드 노보 형성. 2 그러나, 최근의 연구는 식별 및 성인 말초 혈액 내피 전구 세포 (내피 전구 세포)를 순환 한 절연. 이러한 세포 배양에 성숙한 혈관 내피 세포로 분화 할 수있는 능력을 보유하고 생후 혈관 형성에 참여하는 것으로 생각된다. 3,4 이러한 분리 및 내피 전구 세포의 팽창에 대한 프로토콜은 전형적 vascul 포함한 내피 세포 성장 인자를 함유하는 배지에서 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)의 배양을 수반AR 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 -2. 5-8 EPC 배양이 크게 상이한 다양한 종류의 세포를 생산한다. 초기 배양 (&lt;7 일) &quot;초기&quot;내피 전구 세포로서, 문헌에 공지 된 단핵구 세포 유형에 의해 지배된다. 그들의 이름에도 불구하고,이 세포는 단핵구 마커 CD14 표현, 전구 마커 CD34에 대한 부정하고 고전적인 내피 마커 CD31와 VEGF 수용체 2 (VEGFR2)의 최소한의 수준을 표현한다. (5) 계속 배양 세포의 2 인구 상승을 제공, 내피 세포와 같은 세포로 신중 식민지를 나타 늦게 가지 내피 전구 세포 또는 혈액 가지 내피 세포 (BOECs)라고도합니다. 단핵구 초기 내피 전구 세포와는 달리, 또한 내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs), 부산물 내피 세포 또는 늦은 가지 내피 세포라고 한 BOECs은 내피 세포 단일 층의 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 표면 마커 매우 유사하다5 유전자 발현 (9)는 내피 세포를 성숙. 말초 혈에서 내피 형 세포의 생성은 특히 폐동맥 고혈압 (PAH) (10) 또는 폰 빌레 브란트 병. 11 이전 BOECs의 가용성, 내피 같은 혈관 장애와 연관된 내피 세포 기능 부전의 연구를 위해 몇 가지 장점을 제공한다 셀은 출생시 제대 정맥에서 사망 또는 장기 이식, 또는 고립의 시간에 외식 기관에서 파생 될 수있다. 가용성이 감소 심혈관 질환뿐만 아니라, 내피 세포 및 혈액 세포 중 또는 벽화 세포 사이의 상호 작용이있는 환자로부터의 내피 세포 생물학을 이해하는 심각한 제한을 나타낸다. 더욱이, 단리 및 이들 소스에서 내피 세포의 순수 인구를 배양하는 것은 기술적 도전과 이들 방법에 의해 유도 된 세포에서만 발현 기간 한정D 증식 능력. BOECs 따라서 환자 유래 차 내피 세포의 분리 및 문화에 대한 가치있는 대리를 제공합니다. 그들의 시험 관내 애플리케이션 외에 BOECs는자가 세포 이식 치료에 잠재적으로 유용하다. 이러한 애플리케이션은 13 BOEC 유래 iPSCs 질병 모델에 사용될 수 혈관 신생 (내부 (12) 및 참조를 참조)를 촉진하기 모두 내피 세포 이식뿐만 아니라, 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성 (iPSCs 참조). 포함 개시로서 막대한 잠재력을 제공 자가 세포 치료에 대한 자료. BOECs 빠르고 피부 섬유 아세포보다 높은 효율로 재 프로그램. 또한, BOECs도 번역 응용 프로그램에 적합합니다 모든 기술의 필수적인 기능입니다 핵형 이상, 무료입니다 iPSCs의 생성을 가능하게합니다. 환자의 혈액 샘플로부터 iPSCs를 생성하는 기능LSO함으로써 상처 치유 장애, 또는 매우 어린 환자로부터 세포의 생성을 촉진하는 피부 생검에 대한 필요성 및 피부 섬유 아세포의 생성을 제거한다. 아래 설명 프로토콜, 승인 및 국립 연구 윤리 서비스위원회 (영국 이스트)의 지침에 따라 수행은 비교적 작은 부피에서 90 % 이상의 효율로 BOECs의 생성을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법 (60드립니다 ㎖) 말초 혈액의. 이러한 세포 증식 높게하고 단일 혈액 샘플에서 세포 수억의 생성을 허용 반복 계대 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;For blood collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringe with luer-lok tip</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>19G Surflo Winged Infusion Set</td><td>Terumo</td><td>SV-19BL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tube</td><td>StarLab</td><td>E1450</td><td>2 per donor</td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td>Martindale Pharmaceuticals</td><td>270541</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For buffy coat isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sterile wrapped plastic transfer pipettes</td><td>Appleton Woods</td><td>KC231</td><td></td></tr><tr><td>Turk&amp;rsquo;s Solution</td><td>Millipore</td><td>1.093E+09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For cell culture, passaging and freezing cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagen (derived from rat tail)</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4236</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.02M Acetic Acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>prepared in reagent grade water</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2MV&lt;br/&gt; (containing Bullet Kit, but not serum)</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>&lt;strong&gt;Note:&lt;/strong&gt; It is essential that the medium does not contain heparin.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Do not use&lt;/strong&gt; EGM-2.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined</td><td>Hyclone</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>T4174</td><td>Dilute to 1x in PBS prior to use</td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For flow cytometric characterization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555397</td><td>Mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;k, Clone: WM59&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>555445</td><td>Mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;k, Clone: WM59&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>555824</td><td>Mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;k, Clone: 581/CD34&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560976</td><td>Mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;k, Clone: HI30&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB357A</td><td>Mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;, Clone: 89106&lt;br/&gt; Dilution: 1:10</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;k isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td>Clone: MOPC-21&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse IgG&lt;sub&gt;1k&lt;/sub&gt; isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Clone: MOPC-21&lt;br/&gt; Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse IgG&lt;sub&gt;1k&lt;/sub&gt; isotype control</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>IC002A&lt;br/&gt; Dilution: 1:10</td><td>Clone: 11711</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For immunofluorescent microscopy&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24-well tissue culture plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB72271</td><td>Clone 756510, IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;, use at 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF938</td><td>Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300</td></tr><tr><td>Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)</td><td>Abcam</td><td>ab154193</td><td>Clone EPSISR15, use at 1:250</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11055</td><td>Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-10042</td><td>Polyclonal,&amp;nbsp; 2 mg/ml, 1:200</td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 1 &amp;mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

혈액 60 ml의 버피 코트로부터 단핵구 세포의 분리는 통상적으로 6 100-150x10 총 백혈구를 산출한다. 하나의 T-75 플라스크에 도금하면 unlysed 세포 현탁액 중의 세포의 다수가 곤란 시야 현미경을 사용하여 개개의 세포 부착 성을 해결할 수있다. 반복 매체의 변화는 비 부착 세포의 간극이 발생할와 &quot;초기&quot;내피 전구 세포 단핵구의 부착 인구의 시각화 할 수 있습니다. 7 일에서, T-75은 약 7 × 6이 연장 된 부착 세포를 포함합니다. 7-14 일에서 BOECs의 식민지 플라스크 (그림 2A) 내에서 나타납니다. 식민지는 처음으로 3-5 인접한 세포를 나타납니다. 가지 콜로니 수는 혈액의 60 ml의 당 1 ~ 10 식민지에서 다를 수 있습니다. 일반적으로, 젊은 기증자 (즉 20-25 세)도 이전 문화에 나타날 가지 식민지, 더 많은 수를 생성하는 경향이있다.BOECs은 수백 개의 세포로 이루어진 원형의 콜로니를 형성하는 세포의 중앙 군에서 증식. 이러한 식민지 내에서 세포 고전 내피 조약돌 형태를 나타낸다. 콜로니들은 당 약 1,000 세포를 포함 때 통로 초기 콜로니하는 것이 바람직하다. 가지 식민지는 일반적으로 칠일 문화에 자신의 원래 모양 후이 크기에 도달합니다. 원래 콜로니 새로운 T-75 플라스크에 계대되면, 이들은 오일 이하 (도 2b) 내에 합류 단층 (플라스크 당 3-5x10 106 세포)를 형성하기 위해 증식한다. 아이솔레이션의 작은 비율에 (&lt;10 %), 가지 식민지가 나타 실패, 또는​​ 초기 계대 단계 다음 충분히 증식하지 않습니다. 첫 계대 후 낮은 증식을 전시 BOECs 거의 안정 BOEC 절연 부가 종종 2-3 통로 내에서 증식 정지로 이동합니다. 단핵구BOEC 문화에 포함 된 초기 내피 전구 세포는 비 증식하며, 일반적으로 1 ~ 2 구절에서 문화에서 지워집니다. 이러한 초기 세포의 정리가 세포 사멸로 인해, 초기 세포의 실패는 계대 반복 계대와 비 증식 초기 내피 전구 세포의 희석 한 후 다시 부착합니다. 항로 1 세포는 하나의 문화에 더 계대 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다. 안정한 분리가 생성되면, 세포는 최대 정지되기 전에 통로 (8) 또는 (9)까지 3-5 새로운 T-75 플라스크에 합류 한 플라스크의 속도로 계대 될 수있다. 다시, 세포 밀도는 배양에 걸쳐 매우 중요하다. 우리의 경험에서, 더 적은 75 만 이상의 세포 성장 체포 될 수 있습니다 낮은 세포 밀도로, T-75 플라스크에 도금해야한다. BOECs의 높은 증식 잠재력에도 불구하고, 세포는 overconfluent 될 수해서는 안된다 (예.&gt; 플라스크 당 5 × 6 셀)이 CONVERS의 원인이 될 수 있습니다<html> 비 증식 표현형 BOECs 이온. 우리는 BOEC가 내피 세포 마커에 적합한 세포 표면 및 세포 내 염색을 표시해야 임의의 셀이 표시되는 것을 제안한다. BOECs의 전형적인 특성은 내피 세포 마커 염색 다음, 유동 세포 계측법 (도 3) 또는 형광 현미경 (도 4)에 의해 달성 될 수있다. BOECs은 내피 세포 표면 마커 CD31과 VEGFR2에 대한 긍정적 및 단핵구 마커 CD14 및 범 백혈구 마커 CD45에 대한 부정이다. BOECs 또한 Weibel-Palade의 몸을 posess 따라서 이산, 반점 세포질 염색으로 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)을 표현한다. 이러한 폐동맥이나 대동맥 내피 세포와 같은 다른 성숙 내피 세포 유형과는 달리, BOECs는 또한 표면에 전구 및 활성화 마커 CD34를 표현한다. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; 내피 성장 배지 안의 콜라겐 - 코팅 된 플레이트에도 1 BOEC 세대 프로토콜의 개략도. 말초 혈액 단핵 세포는 밀도 구배 원심 분리하여 정맥혈로부터 단리되고 배양은 FBS를 함유 정의. BOEC 식민지 문화 7-14 일 이내에 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> 그림 대표 BOEC 문화 2. 시야 이미지. (A) 파생물 식민지 조약돌 단층으로 배열하고 중앙 지점에서 반경 밖으로 확산되는 내피 세포와 같은 세포의 집합으로 존재 일 7 (14) 식민지 사이의 문화에 나타납니다. 주변 가지 식민지가 부착 모노입니다초기 문화에서 세포의 대부분을 구성하는 cytic 세포. 이전에 설명한 바와 같이 이들 세포는 &quot;초기&quot;내피 전구 세포는, 스핀들 형상의 형태를 가지고 단핵구 마커 CD14을 발현. 비 증식 단핵구 세포가 죽어 또는 계대 후 다시 연결에 실패 중 하나로 (B)는 계대 후, 높은 증식 BOECs은, 문화를 정복. 스케일 바 250μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> 그림 유동 세포 계측법에 의해 BOECs 3. 특성. BOECs는 트립신 특정 표면 마커 (레드 라인)에 대항 형광 접합 된 이소 제어 항체 (채워진 피크 회색) 또는 항체로 염색 하였다. 세포 계측 특성화 표면 마커조혈 마커 CD45과 CD14, 내피 마커 CD31과 VEGFR2 및 progentior과 내피 세포 활성화 마커 CD34. 포함 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> 내피 세포 마커 BOECs 그림 4. 면역 형광 염색법. BOECs의 대표적인 면역 형광 이미지는 내피 세포 표면 마커 CD144에 대한 항체와 (-cadherin의 VE, 오른쪽 상단 패널)와 혈액의 당 단백질 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의, 오른쪽 아래 패널) 면역 염색 . 핵 DAPI 염색을 보여 해당 패널은 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바는 50μm. CD144에 대해. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood at JoVE.com

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

generation-culture-blood-outgrowth-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K 조회수.  University of Cambridge. This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

비디오: Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

연구

발생학

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

생물학

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

생체공학

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

돼지 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)의 특성화

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...