이 프로토콜은 다양한 조직 공학, 세포 치료 및 질병 모델링 조사에 사용할 수 있는 고증식성 혈액 성장 내피 세포를 제공합니다. 이 기술은 단일 채혈에서 일관되게 많은 세포를 생성합니다. 이 기술이 성공하려면 가능한 한 빨리 세포를 배양 배지와 인큐베이터 환경으로 빠르게 전환하는 것이 중요합니다.
먼저, 헤파린 용액을 멸균 식염수에서 밀리리터 당 100 단위로 희석하십시오. 2 개의 50 밀리리터 원추형 튜브와 2 개의 60 밀리리터 주사기 각각에 3-4 밀리리터의 헤파린 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 밀리리터 헤파린 용액 당 희석되지 않은 1, 000 단위를 확장 튜브에 넣습니다.
헤파린으로 채워진 연장 튜브의 한쪽 끝에 19게이지 바늘을 연결하고 연장 튜브의 다른 쪽 끝에 헤파린 함유 60밀리리터 주사기를 연결합니다. 다음으로, Betadine 스크럽 용액으로 마취 된 돼지의 대퇴골 사타구니 부위를 청소하십시오. 19 게이지 바늘로 대퇴 정맥이나 동맥을 뚫고 초당 1-2 밀리리터의 속도로 천천히 50 밀리리터의 혈액을 주사기에 넣습니다.
바늘을 제자리에 두고 즉시 연장 튜브를 꼬고 60밀리리터 주사기를 분리합니다. 혈액을 헤파린이 함유 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 천천히 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 단단히 덮고 튜브를 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
나머지 헤파린 함유 60 밀리리터 주사기를 연장 튜브에 연결하십시오. 연장 튜브를 풀고 천천히 50 밀리리터의 혈액을 주사기에 넣습니다. 즉시 동맥이나 정맥에서 바늘을 제거하고 연장 튜브에서 남은 혈액을 주사기로 천천히 끌어들입니다.
확장 튜브에서 60 밀리리터 주사기를 분리하고 혈액을 나머지 헤파린 함유 50 밀리리터 원추형 튜브로 천천히 옮깁니다. 50밀리리터 원뿔형 튜브를 단단히 덮고 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다. 돼지의 대퇴골 사타구니 부위에 압력 지혈을 가하십시오.
4개의 50밀리리터 원뿔형 튜브에 PBS로 혈액을 일대일로 희석합니다. 25 밀리리터의 실온, 즉시 사용 가능한 밀도 구배 용액을 8 개의 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 추가합니다. 밀도 구배 용액을 함유하는 각 50 밀리리터 원뿔형 튜브 내부에 25 밀리리터의 혈액 식염수 용액을 피펫 팁에 날카로운 각도로 유지하여 천천히 피펫팅한다.
튜브를 560g 및 실온에서 30분 동안 원심분리합니다. 밀도 구배 용액 위와 투명 플라즈마 아래의 단핵 세포의 흐린 층인 버피 코트를 얇은 피펫으로 각 튜브에서 조심스럽게 수집하여 두 개의 새로운 50밀리리터 원추형 튜브에 고르게 분배합니다. 튜브가 포함된 밀도 구배 용액을 폐기하십시오.
6웰 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅하려면 멸균수에서 밀리리터당 1밀리그램으로 희석하여 인간 혈장 피브로넥틴의 원액을 만듭니다. 3 밀리리터의 PBS에 600 마이크로 리터의 피브로넥틴 원액을 희석하여 3.6 밀리리터의 피브로넥틴 작업 용액을 만듭니다. 600 마이크로리터의 피브로넥틴 작업 용액을 6웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들었다.
그리고 각 우물에서 용액을 부드럽게 흡인하십시오. 피브로넥틴이 코팅되기를 기다리는 동안 단핵 세포를 세척하려면 최대 45 밀리리터의 PBS로 튜브를 채우고 560 X g 및 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 두 튜브에서 상층액을 흡인합니다.
각 세포 펠릿을 25 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨다. 각 세포 펠릿을 5 밀리리터의 PBS에 재현 탁하고 15 밀리리터의 0.8 % 염화 암모늄 용액을 각 튜브에 첨가한다. PBS를 첨가하여 이전과 같이 세포를 세척한다.
두 튜브에서 상층액을 흡인합니다. 각 세포 펠릿을 25 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨다. 10% FBS 및 1X 항생제-항진균 용액으로 보충된 EGM-2 배양 배지 6밀리리터에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2 밀리리터의 세포 현탁액을 피브로넥틴이 코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰로 부드럽게 옮기고, 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들었다. 세포를 파종한 후 24시간 후, 1밀리리터의 신선한 배양 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가한다. 다음날, 각 웰로부터 1.5 밀리리터의 배양 배지를 부드럽게 흡인하고, 이를 1.5 밀리리터의 신선한 배양 배지로 교체한다.
다음 5일 동안 웰당 2밀리리터의 신선한 배양 배지로 배양 배지를 부드럽게 교체합니다. 저전력 4X 대물광 현미경으로 세포 배양을 정기적으로 시각화합니다. 배양 개시부터 BOEC 콜로니가 관찰될 때까지 배양된 세포의 형태를 관찰하였다.
더 작은 집단의 부착 세포가 배양 접시에 부착되어 성장하기 시작했고, 비부착 세포는 배양 배지 변경으로 제거되었습니다. 콜로니는 중심점에서 방사상으로 바깥쪽으로 증식하는 내피 유사 세포의 집합체로 6일째에 처음 나타났습니다. 배양이 진행됨에 따라 세포 콜로니는 더욱 조밀해졌고 성숙한 내피 세포와 유사한 조약돌 형태를 나타냈습니다.
2차원 위상차 현미경을 사용하여 무혈청 배지 및 완전 성장 배지에서 튜브 형성을 이미지화했습니다. 두 배지 조건의 세포는 형태학적 분화를 겪었고 모세관과 같은 구조의 광범위한 네트워크로 빠르게 조직되었습니다. BOECs는 성숙한 내피 세포 마커 CD31 또는 혈소판 내피 세포 부착 분자 1의 발현을 추가로 특성화하였다.
BOEC는 CD31의 균일한 발현을 보였다. 또한, 양성 대조군과 비교하여 CD14 AF 700 항체를 사용한 BOEC의 유세포 분석 결과, PBMC의 양성 대조군과 비교하여 단핵구 마커 CD14에 대해 음성으로 염색된 세포로서 EPC의 부재가 확인되었습니다. 양성 CD14 염색은 파란색으로, 염색되지 않은 세포는 빨간색으로 표시되었습니다.
혈액을 채취하는 동안 가능한 한 많은 버피 코트 층을 수집하고 인접한 층을 가능한 한 적게 수집하는 것이 중요합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 자가 혈액 성장 내피 세포가 있는 돼지 모델을 사용하여 이식형 심혈관 장치를 내피화하기 위한 새로운 전략을 연구할 수 있었습니다.
