오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 및 퇴행성 또는 재생 과정을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 그들의 신경 보호 잠재력에 대 한 후보 분자를 신속 하 게 검사 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 조직 세트 아키텍처 및 네이티브 세포 세포 연결이 섹션의 평면 내에서 보존되기 때문에 해리된 1 차 세포 배양과 비교하여 생체 내 조건에서 밀접하게 모방됩니다.

여기에서 우리는 발달소뇌에 있는 Purkinje 세포 죽음의 연구 결과 보여줍니다. 그러나 organotypic 슬라이스 배양은 거의 모든 중추 신경계 지역에서 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 데 똑같이 적합합니다. 제니퍼 Rakotomamonjy와 절차를 시연 숀 맥더모트, 내 실험실에서 기술자가 될 것입니다.

소뇌 조각을 수확하기 전에, 멸균 된 생물 안전 캐비닛에서, 진공 여과 배양 배지의 1 밀리리터로 6 웰 배양 판의 각 우물을 채우고, 치료 우물에 관심의 약리학제를 추가하고, 제어 우물에 차량의 동등한 볼륨을 추가합니다. 멸균 집게를 사용하여 각 우물에 0.4 마이크로미터 모공 크기의 PTFE 멤브레인 필터 를 배치하여 각 멤브레인과 배지의 인터페이스에서 거품을 피하고 배지를 섭씨 37도 및 5 %의 이산화탄소 인큐베이터로 2 시간 동안 상화합니다. 소뇌를 수확하려면 직선 드레싱 포셉을 사용하여 코로 새끼 머리를 잡고 직선 눈 가위를 사용하여 뒤쪽 끝에서 중간선으로 두피를 잘라냅니다.

같은 방식으로 두개골을 열고, 소뇌를 손상시키지 않도록 가위 팁을 바깥쪽으로 가리키고, 주걱을 사용하여 감기 HBSS와 포도당 밀리리터 당 5 밀리그램을 포함하는 60mm 접시로 뇌를 옮기십시오. 직선 드레싱 집게를 사용하여 소뇌를 조심스럽게 해부하고 멸균 곡선미세 포셉을 사용하여 티슈 헬기의 절단 테이블에 플라스틱 디스크에 조직을 배치합니다. 절단 테이블을 회전하여 기생절 단면도의 획득을 허용하도록 조직을 방향을 지정하고, 블레이드가 조직의 가장자리에 위치 할 때까지 절단 테이블을 이동하는 테이블 방출 노브를 오른쪽으로 당깁니다.

그런 다음 슬라이스 두께를 350 마이크로미터로 조정하고 블레이드 속도를 중간 크기로 조정하고 헬기를 시작합니다. 전체 소뇌가 슬라이스되었을 때 헬기를 끕니다. 멸균 집게를 사용하여 디스크를 새로운 60mm 접시 위에 고정하십시오.

전달 파이펫을 사용하여 디스크 위에 HBSS 플러스 포도당을 플러시하여 슬라이스가 접시에 빠지게됩니다. 그런 다음 샘플을 가능한 한 최소화하고 마이크로 프로브를 사용하여 슬라이스를 분리합니다. 6웰 플레이트의 개별 세포 배양 삽입에 대한 소뇌의 부분을 선택하고 마이크로 프로브를 사용하여 각 삽입물의 중앙에 슬라이스를 배치합니다.

모든 슬라이스가 배치되면, 신중하게 여분의 HBSS 플러스 포도당을 흡인하고, 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 면역 형광 염색의 경우 각 우물에서 상체를 제거하고 PBS로 인서트를 세척하십시오. 각 인서치의 우물에 차가운 4% 파라포름알데히드 1밀리리터와 각 인서서 위에 500마이크로리터를 1시간 동안 고정합니다.

고정이 끝나면 각 인서트 아래에 1 밀리리터의 신선한 PBS와 궤도 셰이커에 세척당 각 인서트 위에 500 마이크로리터의 신선한 PBS를 10분 동안 4회 세척합니다. PBS-TB의 500 마이크로리터로 24웰 플레이트의 각 웰을 미리 채우고, 페인트 브러시를 사용하여 각 세포 배양에서 소뇌 조각을 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮기합니다. 1시간 동안 실온에서 슬라이스를 퍼메아빌리즈하고 차단합니다.

인큐베이션의 끝에서, 궤도 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 PBS-TB에서 희석 된 관심의 1 차 적인 항체의 200 마이크로 리터로 세포를 레이블. 다음 날에는 셰이커에서 세척당 10분 동안 4회, 시료 500마이크로리터를 세척한 후, 셰이커의 실온에서 2시간 동안 적절한 불소엽소 공조 보조 항체로 샘플을 표시하여 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 10분 동안 적절한 핵 얼룩 500마이크로리터를 장착하여 빛으로부터 보호합니다.

그리고 유리 슬라이드에 조각을 장착하기 위해 전송 파이펫을 사용합니다. 그런 다음 PBS로 재수화하고 약 80 마이크로리터의 장착 매체로 코팅 된 커버립으로 조직을 장착하기 전에 섹션을 완전히 건조하게하십시오. 마운팅 매체가 경화되면 소뇌 섹션을 이미지화할 준비가 되었습니다.

6일째산후, Purkinje 세포 생존은 그들의 알려진 취약성 창과 일치하는 통제 견본에서 낮습니다. 기증자 동물이 나이가 들고 이 중요한 시기를 종료함에 따라 생존율이 증가합니다. 염화칼륨의 고농도와 소뇌 슬라이스의 치료는 탈극화와 생존의 성공적인 유도결과.

일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 건강한 소뇌 섹션을 선택하고 가능한 한 효율적으로 문화 설정을 수행하는 것이 중요합니다. 배양 후 응용 분야는 면역 형광을 넘어섭을 넘어섭다. organotypic 슬라이스로 게놈 단백질 발현 연구에 사용할 수 있습니다., 그리고 전기 생리학 및 칼슘 라이브 이미징을 사용 하 여 신경 회로 활동을 모니터링 하기 위해.