Name: a fast air-dry dropping chromosome preparation method suitable for fish in plants
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
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We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.

1. 염색체 준비 <ol><li> 종자 발아 및 뿌리 끝의 고정 <ol><li> 22 ~ 24 ℃에서 2 일간 어두운 조건에서 배양 접시에 촉촉한 필터 종이의 두 층에 10 ~ 20 보리 씨앗을 발아. 면도날을 사용하여 시드로부터 1-2cm의 길이 격렬한 뿌리 잘라. </li><li> 분쇄 된 얼음 - 물에 차가운 수돗물을 함유하는 500 ㎖의 유리 병을 배치하여 빙 냉수를 준비한다. 빙 냉수를 폭기 및 중기 세포의 빈도를 증가시키기 위해 20 시간 동안 뿌리 끝 부분을 넣는다. </li><li> 50ml의 에탄올에 물을 뿌리 전송 : 아세트산 (3 : 1)을 고정 제 2 일 동안 실온에서이를 해결하기 위해. 갓 준비 에탄올에 보관 뿌리 : 아세트산 (3 : 1) 4 ° C에서 정착 년까지 사용할까지. </li></ol></li><li> 세탁 효소 처리 <ol><li> 5 분 50 회 mL 유리 비커를 사용하여 30 mL의 얼음처럼 차가운 수돗물로 씻어 뿌리 10-20. 쌍안 현미경을 사용합니다. 에 의해 뿌리 하나를 전송30 mL의 0.01 M 시트 레이트 완충액 (+ 0.01 M 시트르산 나트륨, 0.01 M 시트르산, pH를 4.8) 겸자를 사용하여 5 분 동안 두번 유리 비커를 흔들어 씻는다. 완전히 액체를 제거하고 차단 원하지 않는 비 분열 조직을 면도날을 사용하여 필터 종이에 뿌리를 놓습니다. </li><li> 시계 접시로 식물 조직을 부드럽게 약 50 분 (표 1), 37 ° C에서 1 ㎖의 효소 혼합물에 20 뿌리 끝까지 배양한다. 효소 혼합물 0.01 M 구연산 버퍼에 희석 0.7 % 셀룰라아제 R10, 0.7 %의 셀룰라아제, 1 % pectolyase과 1 % cytohelicase가 포함되어 있습니다. -20 ℃에서 효소 혼합물을 저장하고 다섯 번까지 재사용. </li><li> 피펫으로 효소를 제거하고 잔류 효소를 대체하기 위해 두 번 5 ml의 0.01 M 구연산 버퍼와 얼음에 뿌리 끝을 씻는다. </li></ol></li><li> 루트 침용 <ol><li> 두 번주의 깊게 같은 시계 접시에 1 ml의 96 % 에탄올로 세척 루트 팁. 갓 준비 고정액 (25 % 에탄올 75 % 아세트산)와 에탄올을 교체합니다. 10 ~ 15를 사용하여루트 팁 당 μL 정착. </li><li> 해부 바늘이나 집게로 2 ML 튜브에 정착와 함께 전송 루트 팁과 분해 루트 분열 조직. 세포 현탁액을 얻기 위해 세포를 다시 중단 튜브 20 번 눌러. 2 개월 -20 ° C 최대의 세포 현탁액을 저장합니다. </li></ol></li><li> 세포 현탁액의 적하 <ol><li> 50 ° C에서 뜨거운 접시에 물을 적신 종이 조직의 2 ~ 3 층을 놓습니다. 30 분 동안 냉장고에 얼음처럼 차가운 수돗물에 현미경 슬라이드를 담가. 장소는 축축한 종이 티슈 위에 슬라이드. </li><li> 피펫 7-10 세포 현탁액의 μL와 핫 플레이트에 배치 된 냉각 슬라이드에 20cm의 거리에서 드롭합니다. 피펫 (10) 슬라이드에 세포 현탁액과 같은 장소에 아세트산 - 에탄올 혼합물의 μL 및 추가 2 분 동안 핫 플레이트에 슬라이드를 유지. 물티슈없이 핫 플레이트에 슬라이드를 배치하고 1 분 동안 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 품질 관리 및 스토리지 박슬라이드의 전자 <ol><li> 염색체 스프레드의 품질을 제어하는​​ 위상차 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인한다. -20 ° C에서 코 플린 항아리에 96 %의 에탄올에 침지하여 같은 날 또는 저장 중 슬라이드를 사용합니다. </li></ol></li><li> 물고기 전에 슬라이드 전처리; 모든 단계는 실온에서 수행 <ol><li> 배 SSC의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 5 분 (20 배 SSC는 3 M의 NaCl 300 MM의 트리 소듐 시트 레이트를 포함). 3-10 분 동안 45 % 아세트산 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리 집게, 이전 슬라이드를 사용. </li><li> 전달은 10 분 동안 2 배 SSC 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리에 슬라이드. 10 분 동안 (2 × SSC)에 4 % 포름 알데히드의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리로 전송 슬라이드 빠져들게 슬라이드 염색체를 해결하려면. </li><li> 50 ml의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리, 4 분 각각의 슬라이드 3 회 세척하여 포름 알데히드를 제거합니다. 수직에서 70 %의 시리즈에서 2 분, 90 %, 100 % 에탄올, 각각 건조 슬라이드의 코 플린 항아리에 슬라이드를 탈수위치. </li></ol></li></ol> 제자리 하이브리드 2. 형광 (물고기) <ol><li> 각 슬라이드에 대해, 탈 포름 아미드 10 μL, 4X 혼성화 완충액 5 μL를 사용하여 총 20 μL의 혼성화 용액을 제조 하였다 (200 ㎕를 완충액 80 ㎕의 20 배 SSC, 8 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH가 8.0를 포함 1.6 ㎕의 0.5 M EDTA, 11.2 μL 10 μg의 / μL 연어 정자와 99.2 μL의 DNase를없는 물), 프로브의 3 μL와 DNase를없는 물 2 μL. </li><li> 24 X 32mm 커버 슬립과 슬라이드 커버 당 혼성화 용액 20 μl를 추가하고 고무 시멘트와 커버 슬립을 체포. 핫 플레이트에서 2 분 동안 80 ℃에서 프로브와 동시에 슬라이드 변성. </li><li> 전송 습기 챔버에 슬라이드와 37 ° CO / N 피 빛 슬라이드를 품어. 배 SSC와 코 플린 항아리에 슬라이드를 세척하여 커버 전표를 제거합니다. 그리고 55-60 ° C의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 20 분 동안 품어. </li><li> 실온에서 2 분 동안 코 플린 항아리에 SSC를 2 배 슬라이드를 놓습니다. 각각 70 %, 90 %, 100 % 에탄올, 일련의 2 분 동안 코 플린 항아리 슬라이드 탈수. </li><li> 강렬한 빛을 방지, antifade 설치 매체에 / ㎖ 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindoline 1 μg의 (DAPI)과 슬라이드와 Counterstain과를 공기 - 건조. </li></ol> 3. 현미경 분석 및 저장 <ol><li> 표면 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석한다. 필터의 선택은 라벨 프로브 형광 색소 사용에 의존한다. 필요한 경우, 1 년까지 어두운 조건에서 4 ° C에서 저장 슬라이드. </li></ol>

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	<li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+(Cruciferae)+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads.">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li><li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes.">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li><li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro.">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li><li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy.">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li><li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. 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The authors have nothing to disclose.

염색체 준비 실험 잔디 가족 (벼과)에 속하는 시리얼 어린 뿌리를 이용하여 수행되었다. 모든 분석 종은 이배체 게놈 세트 14 상대적으로 긴 유사 분열 중기 염색체 (11 ~ 15 μm의)가 큰 게놈 종 (5.1-7.9 GBP)에 속한다. 발아 한 뿌리의 길이가 세포 분열 조직의 최대치를 얻기 위해 2 cm 이상이 아니었다. 분열하는 세포의 동기화 유사 분열 중기의 수량이 10 퍼 향상 20 시간 긴 빙수 처리에 의해 달성되었다. (I) 상대 습도 50 % -55 %와 효소 처리 (II) 시간 : 두 단계 고품질 염색체 제제의 제조를 위해 중요하다. 첫번째 점은 유리 슬라이드의 근접 열판에서 젖은 종이 조직을 배치함으로써 달성되었다. 상대 습도는 습도로 측정 하였다. 공장의 제조를위한 최적의 습도염색체 키로프 등에 의해보고 습도 유사 하였다. 6. 최적의 상대 습도에서 염색체 품질에 긍정적 인 효과는 세포질 및 세포벽 가수 팽윤에 의해 발생한다. 효소 처리 시간은 의존 종 (표 1)이다. 효소 처리의 기간은 또한 루트 에탄올 / 아세트산 정착 및 뿌리의 크기의 시간 간격에 의존한다. 더 이상 뿌리는 적절한 학년에 뿌리를 소화하는 데 걸리는 이상 (4 ° C에서 1 년까지) 고정액에 보관 하였다. 불충분 소화 루트 재료 담가서 부드럽게 어렵고 장기적인 침용의 결과로서 제제의 총 시간을 증가시킬 것이다. 또한, 중기 염색체는 물고기의 실험 기간 동안 프로브 침투 계속되는 방해 할 수 세포질에 포함 된 상태로 유지됩니다. 한편 이상의 소화 물질은 염색체 자체의 구조 및 피해 대상 DN에 영향을 미칠 수있다물고기 분석. 제제의 개선을위한 추가적인 인수는 정착액의 제 방울 (1, 아세트산 / 에탄올 3)의 사용이다. 이 혼합물에 아세트산 고농도 세포질의 소화를 촉진하고 큰 염색체 종 염색체 확산을 촉진시킨다. 세포질 감소는 또한 슬라이드 염색체의 고정 후 일어날 수있다. 이 목적을 위해 염색체 스프레드 운반 현미경 슬라이드는 2-10 분 세포질 레벨에 따라 실온에서 45 % 아세트산에서 배양 할 수있다. 염색체 스프레드의 품질 검사는 어떠한 부가 염색법 (예를 들어, 1 % 아세토-카민)없이 위상차 현미경으로 수행 하였다. 일반적으로 고품질의 염색체 스프레드를 함유하는 25 개 이상의 슬라이드는 상기 방법을 사용하여 20 뿌리로부터 얻을 수있다. 5S rDNA의 [CTT] (10)를 사용하여 유사 분열 중기 염색체에 물고기 실험의 결과, 6 KB 긴 단일 복사 프로브 (FPct_40752는) 별개의 (그림 2) 위에서 설명한 모든 종에 대한 높은 품질했다. 이 방법의 명백한 이점은 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로서 잘 확산, 손상되지 않은 수많은 중기 염색체이다. 그것은 2 개월까지 -20 ℃에서 세포 현탁액을 저장하고 염색체 FISH 실험 당일 확산 제조 할 수있다. 우리는 이러한 염색체에 혼성화 신호 품질 갓 제조 중기 스프레드에 비해 감소되는 것을 관찰했지만 갓 준비한 슬라이드는 96 % 에탄올로 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 빠른 공기 건조 낙하 기술에 의해 제조 된 염색체 스프레드는 물고기에 적합했고, 여러 번 재현했다. 생선이 염색체의 제조 방법의 조합은 널리 핵형 11, CHROMOS을 위해, 예를 들어, 식물의 게놈 조직을 탐험 적용 할 수합성 연구에서, 물리적 및 유전자지도 (13)의 통합을위한 매핑 OMAL 12.

계내 혼성화 (FISH)의 형광은 염색체 수준에서 단일 및 높은 복사 서열의 물리적 맵핑에 대한 효과적인 도구이다. 전제 조건은 높은 품질의 염색체 스프레드의 준비입니다. 동물과 식물 세포에 대한 동등하게 적합 할 것이 더 일반적인 염색체 준비 프로토콜이 없습니다. 식물 염색체의 준비로 인해 다른 종 내에서 단단한 세포벽과 각종 세포질의 일관성에 특히 도전이다. 식물 염색체의 제조를위한 바람직한 방법 중 하나는 드롭 확산 기법 및 공기 - 건조 기술로 알려진 1,2 소위 드롭 기술이다. 이 방법은 처음 체외 성장 포유 동물 세포 3 Rothfels과 Siminovitch에 의해 1958 년에 도입되었다. 나중에 마틴 등 알. 4 카토 등. 5는 식물이 방법을 적용. 최근 방법이라는 &#39;SteamDrop &amp;# 39; 비 중첩 염색체 (6)의 제조에 수증기를 사용하는 개발되었다. 높은 습도의 긍정적 인 영향은 이전 관찰되었지만 7 &#39;SteamDrop&#39;는 고품질 염색체 제제 (6)의 제어 흐름을 제공한다. 증기 처리는 아마도 염색체 단백질의 일부​​ 수정에 접속 염색체 연신시킨다. 전체 중기의 충분한 수의 고정 후속 물고기 실험은 기술적 인 전문 지식을 필요로 확산 있지만 중기 스프레드 결과의 품질은 매우 높다. 여기에서 우리는 단일 및 높은 사본 프로브 5,8의 물고기 검출에 적합한 유사 분열 시리얼 염색체의 제조를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 카토 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 (9) (도 1)에 의해 설명 풍건 적하 법의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 감소 된 수를 포함그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계. 우리가 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale 높은 품질의 염색체 확산과 물고기 결과를 얻었다이 프로토콜을 사용.

<table><tbody><tr><td>Hot Plate</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase&amp;nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Cytohelicase</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>direct fluorochrome&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>direct fluorochrome&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorecsence microscope</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>fluorecsent dye</td></tr></tbody></table>

a fast air-dry dropping chromosome preparation method suitable for fish in plants

염색체 스프레드의 제조 현장 하이브리드에 형광의 성공적인 성능 (FISH)을위한 전제 조건이다. 높은 품질의 식물 염색체 스프레드의 준비로 인해 단단한 세포벽에 도전한다. 식물 염색체의 제조를위한 승인 방법 중 하나는 소위 드롭 제제, 또한 드롭 확산 또는 공기 - 건조 기술로 알려져있다. 여기, 우리는 유사 분열 염색체의 빠른 준비를위한 프로토콜은 단일 및 높은 사본 DNA 프로브의 물고기 검출에 적합한 확산 제시한다. 이 방법은 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 풍건 드롭 방식의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계의 감소 된 수를 포함한다. 이 방법의 명백한 이점은 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로서 잘 확산, 손상되지 않은 수많은 중기 염색체이다. 이 프로토콜을 이용하여, 우리는 높은 품질을 얻을 CHROMosome 스프레드와 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale에 대한 재현 물고기 결과.

유사 분열 중기 스프레드 현미경 슬라이드는 전술 빠른 공기 건조 적하 염색체의 제조 방법에 의해 제조 하였다 (SUPPL.도 1). FISH 분석은 모두, 반복적이고 단일 - 카피 시퀀스를 사용하여 수행 하였다. 이미지는 대응하는 형광체의 여기를 가능 필터 세트 표면 형광 현미경에 의해 얻은 고감도 CCD 흑백 카메라에 의하여 촬영되었다. 화상 획득을 위해 우리는 화상 취득 소프트웨어가 설치된 컴퓨터를 이용했다. 5S rDNA의 [CTT] (10), 및 단일 복사 프로브를 사용하여 유사 분열 중기 염색체에 물고기 실험의 결과는 별개 있었다 Hordeum vulgare의에 대한 높은 품질의 (Figre 2A, B), H. bulbosum (그림 2C), H. marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale (그림 2D). 이 방법의 명백한 이점은 잘 확산은 손상되지 않은 수많은 충족<html> 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로 제공 aphase 염색체. 그것은 2 개월까지 -20 ℃에서 세포 현탁액을 저장하고 염색체 FISH 실험 당일 확산 제조 할 수있다. 우리는 이러한 염색체에 혼성화 신호 품질 갓 제조 중기 스프레드에 비해 감소되는 것을 관찰했지만 갓 준비한 슬라이드는 96 % 에탄올로 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 방법은 쉽고 효율적이고 재생 가능한 방식으로 시리얼 고품질 염색체 스프레드를 제조하는데 사용될 수 있으며, 가장 가능성이 너무 다른 식물 종에서 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53470/53470fig1.jpg" /> 도 1 풍건 적하 식물 염색체 제조 방법의 순서를 설명하는 방식. ES / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg &quot;/&gt; Hordeum vulgare의, 수평의 유사 분열 중기 염색체 스프레드 그림 2. 물고기 공기 건조 적하 법에 의해 제조하고 bulbosum Secale cereale. (A) &#160; H. 빨간색 형광 염료로 표지 단일 복사본 프로브 (FPct_40752)와 vulgare의. (B) &#160; H. 녹색 형광 염료로 표지 5S rDNA의 프로브 vulgare의. (C) &#160; 녹색 형광 염료로 표지 CTT-의 microsatellite와 수평 bulbosum (D) &#160; 녹색 형광 염료로 표지 pSc119.2 반복 함께 미의 cereale. 모든 염색체는 (빨간색) DAPI으로 대조했다. 물고기 신호는 노란색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53470/53470fig2large.jpg" target="_blank">이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>레. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53470/53470tab1.jpg" /> 다른 종의 효소 처리 표 1. 배양 시간. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53470/53470fig3.jpg" /> SUPPL. 그림 1 단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) Hordeum vulgare의의 예에 자연 건조 떨어지는 식물 염색체의 제조 방법의 유사 분열 중기 염색체 스프레드의 이미지. (A) &#160; 단계 대비 이미지 200X 배율에서 찍은 및 (B) 630X 배율에서 촬영 차등 간섭 대비 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53470/53470fig3large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a>여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K 조회수.  Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK). A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

비디오: A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

연구

유전학

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

발생학

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

면역학 및 감염병학

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

생물학

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

화학

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

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형광성의

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의 준비 Drosophila 태아

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집