CRISPR/Cas9 유전자 편집 약한 전기 물고기에, 특히 비교 맥락에서, 특정 유전자와 유전 적 분산 이 현상 변이에 기여하는 방법에 대한 가설을 테스트 하는 연구원을 가능하게 할 것 이다. CRISPR/Cas9는 돌연변이 F-제로 배아를 생성하는 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜은 연구원이 약하게 전기 물고기의 두 수렴 진화 종에서 CRISPR-Cas9 조작을 수행 할 수 있습니다.
다른 전기 물고기 또는 다른 물고기 종의 몇 가지 수정과 함께이 접근 방식을 사용하는 열쇠는 sgRNAs를 만들기 위해 전사 또는 유전체 자원의 가용성입니다. 2D 평면 내의 3D 위치에서 미세 주입을 수행하고 세포를 시각화하는 것은 어려울 수 있습니다. 일반적인 미세 주입 기술을 연습하기 위해 계란에 대한 작은 제브라피시 식민지를 가져옵니다.
사바스 콘스탄티노우와 함께 절차를 시연하는 것은 제러드 톰슨, 내 실험실에서 기술자가 될 것입니다. 적절한 번식 조건하에서 관심있는 물고기 종을 수용 한 후, 중력으로 보이는 암컷 물고기를 식별합니다. B.gauderio에서 암컷은 통풍구에 소달이 부어 있을 것입니다.
B.brachyistius 에서 여성은 부어 배를 가지고 깊은 몸을 나타납니다. 마취 투여 후, 철저한 혼합과 PCR 튜브에 DPBS의 4 배에 산란제를 추가합니다. 솔루션은 흐리게 됩니다.
파이펫을 사용하여 계산된 용량을 측정하고 28게이지 19~25밀리리터 길이의 beveled 바늘이 장착된 정밀 유리 주사기로 용액을 그리기 전에 희석된 제를 열가소성 플라스틱 조각에 분배합니다. 부드러운 속도로 등대 트렁크 근육에 용액을 주입하고 바늘이 제거하기 전에 2 ~ 4 초 동안 앉아 보자. 그런 다음 즉시 물고기를 신선한 시스템 물에 넣고 복구하십시오.
B.gauderio 정자 수집의 경우, 24 시간 후, 큰 수컷 물고기를 선택하고 퇴학 후 가능한 한 빨리, 특히 머리와 통풍구 주위에 철저하게 물고기를 건조. 말린 생선 복부면을 왼쪽에 앞쪽으로 올려 놓고, MS222에 담근 축축한 종이 타월로 덮여 있어 머리를 테이블과 평행하게 맞설 수 있습니다. 즉시 통풍구쪽으로 곤드를 통해 즉시 빛을 압박하고 팁마이크로 파이프터를 사용하여, 신중하게 50 마이크로 리터 단위로 남성에서 압착으로 정자를 수집으로 장밋방향으로 코달에 압력을 적용합니다.
얼음에 정자 익스텐더 솔루션의 500 마이크로 리터 볼륨에 직접 정자의 알리쿼트추가. 컬렉션 직후, 생선을 점액 코트 보호 상품처리 담수에 넣습니다. B.gauderio 계란 컬렉션의 경우, 마취 된 B.gauderio 암컷 물고기를 건조 한 후 즉시 머리가 지배적 인 손을 향한 측면으로 물고기를 놓고 코달에 압력을 가하여 곤나드를 통해 중간으로 압착하여 곤나드를 향해 간장을 맞습니다.
폴리테트라플루오로틸렌 도구를 사용하여 클로카에서 압착되는 계란을 조심스럽게 수집하고 계란을 덮은 작은 페트리 접시에 빠르게 놓습니다. 압착 후 혼자 작업하는 경우, 그들은 여성에서 추방으로 작은 페트리 접시의 기지에 계란 질량을 터치합니다. 계란을 수집 한 직후, 슬라임 코트 보호 제품 처리 신선한 시스템 물에 물고기를 배치합니다.
B.gauderio 체외 수정의 경우 잘 혼합 된 정자 SES 용액 100 마이크로 리터를 계란 질량 에 직접 넣고 담근 시스템 물 1 밀리리터를 넣습니다. 게임테 서스펜션을 30~60초 동안 철저히 섞은 후 0.22마이크로미터 의 모공 여과 시스템 물을 추가로 추가합니다. 시험관 내 수정 시간으로 접시에 라벨을 지정하고 29도 섭씨 인큐베이터에 접시를 배치하여 개발 진행 상황을 확인하기 위해 50 분 타이머를 설정합니다.
수정 기간 동안 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 관심있는 주입 용액의 두 마이크로 리터를 마이크로 주입 바늘에 역으로 내리고 가능한 한 팁에 가까운 액체를 추방하십시오. 단일 세포가 적어도 하나의 세포의 동물 극에서 형성되면, 해부 현미경으로 접시를 옮기고 바늘의 테이퍼가 강성을 입증하기 시작하는 곳을 향해 경부 각도로 바늘 끝을 깰 미세 집게 쌍을 사용합니다. 바늘의 구멍은 단단한 테이퍼를 유지하면서 가능한 한 작게 유지되어야합니다.
현미경의 밑에 개발 zygotes를 확인하고 페트리 접시의 반전 상단에 설정 유리 현미경 슬라이드의 가장자리에 가능한 한 작은 물에 10 ~ 20 계란을 배치 절단 팁 플라스틱 전송 파이펫을 사용합니다. 섬세한 작업 닦아, 부드럽게 계란슬라이드의 가장자리에 단단히 부착 할 수 있도록 여분의 물을 제거하기 위해 슬라이드를 누릅니다. 물은 슬라이드 아래에 사악하고 가장자리에 계란을 당깁니다.
주사 중 계란의 움직임을 피하기 위해 약간의 서 수분을 유지하면서 계란을 촉촉하게 유지하기에 충분한 물이 있어야합니다. 접근 바늘에 수직으로 슬라이드에 계란을 정렬하고, 초리온에 바늘을 배치하기 위해 미세 조작기를 사용합니다. 그런 다음 바늘을 약 45도 각도로 잡고 먼저 초리온에 팁을 삽입한 다음 단일 세포에 삽입하여 가능하면 노른자를 통해 주입합니다.
미세 한 집게주입 하는 동안 깨진 계란을 제거 합니다. 모든 계란을 주입한 경우, 0.22 마이크로미터 모공 여과 시스템 물의 분출 병을 사용하여 주입 단계에서 계란을 새로운 100mm 직경페트리 접시로 부드럽게 씻어냅니다. 성공적인 짧은 가이드 RNA 선택 및 합성에 따라, 체외 분열은 단세포 미세 주입을 위한 선택을 위해 시험될 수 있습니다.
PCR 정화 및 복제 후, 본 대표적인 실험에서 CRISPR-Cas9 유도돌연변이는 강력한 전기 기관 방전 진폭 감소를 가진 개별 B.gauderio 및 B.brachyistius 클론에서 확인되었으며, 주입되지 않은 제어는 참조된 유전자형만 표시하였다. 확인된 CRISPR 돌연변이체와 에이전트 크기 사이의 전기 기관 방전 진폭의 시각화는 SCN-4 AA 돌연변이 B.brachyistius 와 B.gauderio 배아 모두 대조군보다 전기 기관 방전 진폭이 현저히 낮았다는 것을 입증했습니다. 마이크로 주사를 수행할 때 생존하는 단일 세포 주입 배아의 수를 최대화하기 위해 가능한 한 신속하고 의도적으로 움직입니다.
어려운 계란으로 시간을 낭비하지 마십시오. 성공적인 돌연변이가 확인되면 전통적인 사육 방법은 CRSPR 관련 모자이크 문제를 제거하는 안정적인 돌연변이 선을 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구원이 약한 전기 물고기의 두 수렴 된 종에서 기능 검증과 비교 게놈 연구를 수행 할 수 있습니다.
