Zebrafish는 동종 염색체 페어링, 시냅시스 및 재결합을 포함한 메이오증의 염색체 이벤트를 연구하기위한 우수한 척추 동물 모델로 부상하고 있습니다. 이 핵 표면 확산 프로토콜은 우리가 슈퍼 해상도 현미경 을 사용하여 메이오틱 염색체 아키텍처의 주요 기능을 시각화 할 수있게했습니다. 연구원은 다른 제브라피시 퍼짐 프로토콜보다는 적은 파편으로 슬라이드 당 잘 퍼진 핵의 수백을 기대할 수 있습니다.
이 절차의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 피부에 근접하고 또한 다른 장기에 부착되기 때문에 제브라피시 고환의 해부입니다. 해부 절차를 시각화하면 연구원들이 동물의 조직에 내장 된 gonad를 볼 때 무엇을 기대해야하는지 알 수 있습니다. 수컷 얼룩말물고기를 안락사한 후, 작은 가위로 한 번에 한 마리의 물고기를 참수한 다음 마이크로 가위를 사용하여 복부 중간선을 따라 절단하여 신체 구멍을 노출시합니다.
실리콘 코팅 페트리 접시에 생선을 놓고 1X PBS의 얕은 풀로 덮습니다. 1.65X 배율의 현미경하에서 집게를 사용하여 고환을 해부합니다. 가능한 한 고환에서 지방과 주변 조직을 제거합니다.
gonad는 해부 범위 빛 아래 반투명 으로 표시되며 주변 지방은 약간 어두운 모양을 가질 수 있습니다. 지방의 일부 금액은 절차를 방해하지 않고 gonad에 남아있을 수 있습니다. 해부된 각 고환을 DMEM 2밀리리터가 있는 5밀리리터 튜브에 직접 넣고 얼음을 유지합니다.
고환 세포를 해리하려면 고환이 있는 5개의 밀리리터 튜브에 콜라게나제 용액 200마이크로리터를 추가합니다. 용액을 여러 번 반전시켜 혼합합니다. 섭씨 32도에서 100 RPM에서 인큐베이터 셰이커에서 고환을 수평으로 흔들어 부드럽게 흔들어 줍니다.
10분마다 튜브를 빠르게 반전하여 해리를 용이하게 합니다. 한 시간 후, DMEM은 흐리고 고환은 작은 덩어리에 있습니다. 고환은 콜라게나아제에서 배양되는 동안, 섭씨 37도에 0.1 어금니 자당 용액의 100 마이크로리터를 미리 떼어.
콜라게나아제를 씻어내려면 DMEM을 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 몇 번 반전시면 됩니다. 실온에서 3 분 동안 200g에서 고환을 펠렛. 2 밀리리터만 남을 수 있도록 상퍼의 밀리리터 3밀리리터를 제거합니다.
DMEM 세척을 두 번 더 반복합니다. 마지막 DMEM 세척 후, 슈퍼 나티미터의 4 밀리리터를 제거하고 DMEM의 1 밀리리터, 트립신 용액 200 마이크로 리터, DNase I 솔루션의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 용액을 혼합합니다.
100 RPM에서 32도에서 튜브를 수평으로 흔들어 줍니다. 5분마다 튜브를 빠르게 반전하여 해리를 용이하게 합니다. 5~15분 후에 DMEM 솔루션에는 몇 덩어리만 포함되어 있습니다.
트립신 억제제 용액 500 마이크로리터와 DNase I 용액 50 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 몇 번 섞은 다음 실온에서 3 분 동안 200g에서 잠시 회전하여 튜브 캡 또는 튜브의 측면에 부착 할 수있는 액체 또는 덩어리를 제거하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓고 남은 덩어리의 해리를 용이하게하기 위해 플라스틱 이송 파이펫으로 2 분 동안 반복적으로 피펫을 사용하여 셀 서스펜션을 다시 중단하십시오.
셀 서스펜션이 이송 파이펫의 전구로 들어가지 않도록 합니다. 그런 다음 DMEM으로 100 미크론 세포 스트레이너를 미리 적시고 얼음 위에 50 밀리리터 튜브 위에 놓습니다. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 한 번에 한 방울의 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 전송합니다.
플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 새로운 5밀리리터 튜브로 여과물을 옮김합니다. 필터 의 밑면에 부착 된 풀이 있는 세포를 수집해야합니다. 튜브에 DMEM을 추가하여 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가합니다.
실온에서 5 분 동안 200g의 세포를 펠렛. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하고 5 개의 DNase I 용액을 펠릿에 직접 추가하십시오. 그런 다음 빈 마이크로 센심 분리기 튜브 랙을 따라 튜브의 외부 바닥을 4 ~ 5 번 부드럽게 긁어 내어 DNase I 용액과 펠릿을 섞는다.
DMEM을 5밀리리터의 최종 볼륨에 추가하고 튜브를 여러 번 반전시켜 용액을 혼합합니다. 실온에서 2 분 동안 200g의 셀 서스펜션을 펠렛하십시오. DNase 처리를 DMEM의 추가 시 재중단 된 펠릿이 뭉크하지 않을 때까지 1 ~ 3 번 추가로 반복하십시오.
마지막 스핀 후 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오. 다음으로, 1X PBS의 밀리리터 1개를 추가하고 빈 튜브 랙을 따라 튜브의 바깥쪽 바닥을 부드럽게 긁어내어 펠릿을 다시 놓습니다. 5 분 동안 200 g에서 세포 현탁액을 펠릿한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나탄을 제거하십시오.
조리개를 넓게 하기 위해 200 마이크로리터 파이펫 팁의 끝에서 3밀리미터를 자른다. 컷 파이펫 팁으로 0.1 어금니 자당 용액80 마이크로리터로 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 재보페팅합니다. 셀 서스펜션이 실온에서 3분간 앉게 하십시오.
다음으로 파이펫 팁으로 100 마이크로리터100마이크로리터로 0.15%트리톤 X-100으로 코팅합니다. 그런 다음 자당 세포 서스펜션의 18 마이크로리터를 긴 가장자리에 수직으로 직선으로 슬라이드의 중앙에 추가합니다. 모든 모서리에 셀 서스펜션의 확산을 용이하게하기 위해 앞뒤로 슬라이드를 기울이십시오.
포름알데히드 용액이 건조되는 것을 방지하기 위해 약간 금이 간 열린 습도 챔버에 슬라이드를 평평하게 놓습니다. 밤새 어두운 서랍에 습도 챔버를 놓습니다. 아침에는 습도 챔버에서 뚜껑을 제거하고 슬라이드가 완전히 건조할 수 있도록 합니다.
슬라이드를 코플린 항아리에 넣고 코플린 항아리를 증류수로 채웁니다. 실온에서 부드러운 흔들림으로 5분간 배양하세요. 물을 붓고 항아리를 1~250개의 습윤 제로 채웁니다.
실온에서 부드럽게 흔들리며 각각 5분간 2회 씻으시면 됩니다. 슬라이드가 완전히 건조하고 얼룩될 때까지 영하 20도에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 잘 퍼진 비 겹치는 핵을 산출하는 제브라피시 정자 세포 확산을 준비하고 시각화하는 방법을 설명했습니다.
왼쪽패널에는 메이오틱 프로페이즈, 렙토텐, 초기 지고틴, 파시텐의 3단계가 있습니다. 텔로미어는 각 단계에 대해 마젠타를 염색했다. 부족한 DNase I 처리로 인한 품질 스프레드의 예가 여기에 표시됩니다.
SYCP3에 염색된 메이오성 염색체는 세포가 슬라이드에 제대로 퍼지는 것을 방지하는 점성 자당 세포 현탁액때문에 중첩된 핵을 나타낸다. 정확한 양의 시동 재료로 시작하여 트립신에서 적절한 시간 동안 제브라피시 고환을 치료하고, 필요한 수의 DNase I 치료를 수행하지 못하면 핵이나 덩어리핵이 거의 발생할 수 있다. 적절한 PPE는 포름알데히드로 작업 할 때 항상 착용해야합니다.
확산 절차에 따라 염색체는 다양한 염색체 구조뿐만 아니라 이중 가닥 브레이크를 시각화하여 메이오틱 이벤트의 타이밍 의존성 및 국소화를 분석할 수 있습니다. 우리의 기술은 얼룩말 물고기 염색체 기능 및 텔로미어 꽃다발에 따라 마우스 보다는 인간 적인 정자 발생의 더 나은 모형일 지도 모르다는 것을 보여주는 길을 포장했습니다.
