Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

윤리 문 : 현장 샘플링과 동물 과목을 포함하는 절차는 노팅엄 트렌트 대학의 동물, 농촌 및 환경 과학 (ARES)의 학교에 의해 승인되었습니다. 대변​​ 샘플 1. 컬렉션 참고 : 분변 샘플 및 메탄올을 취급 할 때는 장갑을 착용한다. 동물은 또한 착용해야 실험실 코트와 같은 인수 공통 질병, 보호 복을 앓고 될 수 있다는 강한 의심이있는 경우. <ol><li> 배변 다음 (몇 시간에 분 이내) 가능한 한 빨리 배설물 샘플을 수집하고 샘플 가방에 배치합니다. 약 10 g의 총 중량과 어떤 똥 샘플의 3 ~ 5 부 표본을 가져 가라. 시간과 수집, 개별 ID의 날짜와 가방 레이블 및 분석 때까지 -20 ° C에서 샘플을 동결. </li><li> 모든 샘플을 동결 오차를 최소화 -20 ° C까지의 연구이다 완료 후 일괄 적으로 분석을 위해 함께 샘플을 수집합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 2. 대변 호르몬 추출 <ol><li> 실온에서 해동하는 배설물 샘플을 남겨주세요. </li><li> 샘플을 수동으로 자신의 샘플 가방에 각각의 샘플을 혼합하여 균질화되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 샘플은 무게 보트에서 마이크로 저울에 0.50 분변 물질 (g 0.003 ±)을 무게를 들어 다음 8 ㎖의 유리 병에 대변을 전송합니다. 각 샘플에 대한 새로운 무게 보트를 사용하여 각 샘플 사이에 30 % 메탄올로 핀셋을 청소하십시오. </li><li> 5 90 % 메탄올 용액으로 분뇨 0.5 g의 결합 물, 및 RT에서 오비탈 진탕 기에서 O / N을 흔들어. </li><li> 다음 날 아침, 샘플 와동 후 600g에서 20 분 동안 원심 분리. </li><li> 37 ℃의 온도로 설정된 수욕 랙에 16 × 125mm이 유리관 제자리 메탄올 분획을 경사 분리한다. 흄 찬 공기를 사용하여 건조시켜 증발. 추출 병을 씻어 폐기에 대한 임상 폐기물 가방에 남아있는 대변 펠렛을 배치합니다. </li><li> 100 %에서 1 ml의 메탄올을 대변 추출물을 다시 중단하고 12 X 75mm 2 폴리 프로필렌 튜브에 전송할 수 있습니다. 즉시 분석 할 때까지 -20 ° C에서 모자 및 저장. </li></ol> 3. 호르몬 분석 <ol><li> 클론 코르티 코스 테론의 CJM006 항혈청을 사용하여 효소 연결된 면역 측정법 (EIA)와 분석을 수행합니다. 참고 :. 두 번째 EIA는 (코르티솔 R4866 항혈청을 테스트했지만,이 (4.1 절 참조) 폴리 클로 날 코르티 코스 테론 CJM006 항혈청과 코르티솔 R4866 항혈청과 각각의 HRP의이 CJ 먼로, 캘리포니아 대학에서 제공하는 생화학 적 검증 단계를 달성하는 데 실패, 데이비스, 캘리포니아 </li><li> 1의 항혈청 희석 : 코팅 버퍼 (0.05 M을 NaHCO3, pH를 9.6)에서 15,000 반복적 인 피펫과 50 μL 피펫 팁을 사용하여 / 잘 50 μL와 96 웰 마이크로 타이 플레이트를로드합니다. 접시 실러와 함께 접시를 덮고 4 ° C에서 O / N을 품어. (N을 비 - 특이 적 결합을 나타내는 웰을 코팅되지 않은 두 개의 웰을 남겨SB). </li><li> 사용 직전 자동화 된 마이크로 타이 터 플레이트 세척기 (0.15 M의 NaCl, 0.05 % 트윈 20 세정액)를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 다섯 번 세척 하였다. </li><li> 1,000 페이지 / - NSB의 잘 당 50 μL와 &#39;제로&#39;우물 [EIA 버퍼 (0.1 M 나포 4, 0.149 M의 NaCl, 0.1 % 소 혈청 알부민, pH를 7.0) 만, 표준 (코르티 코스 테론, 3.9으로 판을로드 잘) 또는 적절하게 1시 20분 EIA 버퍼에 희석 배설물 추출물 샘플 (,) 섹션 4.1을 참조하십시오. 표준과 0은 각각 세중 및 4 번씩 실행해야합니다. 희석 배설물 추출물 샘플과 NSB의 중복에서 실행해야합니다. </li><li> 70,000 : 50 ㎕를 첨가 / 웰의 1 EIA 버퍼에 희석 라벨 고추 냉이 퍼 옥시 다제 공액 ᵻ 즉시이 작업을 수행합니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 어둠 속에서 마이크로 타이 플레이트를 품어. </li><li> 100 μL와 함께 어둠 속에서 실온에서 접시를 세척 용액으로 5 회 마이크로 타이 플레이트를 세척하고 품어 / 아RT 기판 [0.4mm의 2,2&#39;- 아지노 디 - (3-ethylbenzthiazoline 술폰산) 디 암모늄 염, 1.6 mM의 H 2 O 2, 0.05 M 시트 레이트, pH가 4.0]의 L. 사용하기 직전에 기판을 준비합니다. </li><li> 미크로 역가 플레이트를 읽는 405 nm의 파장에서 spectrophometer를 사용한다. 제로 웰의 광학 밀도가 0.8 이상 1.0에 도달 할 때 배양 플레이트는 완료된 것으로 간주된다. </li><li> 반복성을 보장하기 위해, 약 30 % (EIA 표준), 50 % (생물학적 샘플 예를 들어, 국내 말 배설물 추출물의 수영장) 70 % (EIA 표준)를 결합하는 EIA 버퍼에 희석 제어 [EIA 표준 또는 생물학적 샘플을 사용 ]는 각각 &lt;10 %의 변화와 &lt;15 %의 인트라 간 분석 계수를 설명합니다. </li></ol> 4. 효소 연결된 면역 : 연구 종과 섹스에 대한 검증 <ol><li> 생물 유효성 검사 (병렬) <ol><li> EIA 버퍼를 사용하여 풀 배설물 여분의 직렬 희석을 수행코네티컷, 이상적으로 여러 사람들로부터 의심 높고 낮은 호르몬 농도 샘플에서 가져온 (범위 : 깔끔한, 1 : 8192 : 2 1)과 3 장에 설명 된대로 EIA에서 실행됩니다. 주 : 분변 추출물의 계열 희석 표준 곡선의 선형 회귀 결과 변위 곡선 평행 수득 때 병렬성이 달성 된 것으로 간주된다 R2&gt; 0.90, 기울기&gt; 0.50 및 p &lt;0.05를 보여준다. 표준 곡선에 약 50 %를 결합하는 일련 묽은 배설물 추출물은 모든 배설물 추출물을 실행하는 데 이상적인 희석을 고려하여야한다 (예를 들면 1:20). 선형 회귀 결과 R2&gt; 0.90 및 p &lt;0.05을 설명 할 때 분석에서 고려 간섭이 없다. </li></ol></li><li> 생물 유효성 검사 (간섭) <ol><li> 50 %로 희석 적절하게 풀 희석 된 배설물 추출물 [200 μL가 paralleli에 의해 결정 바인딩과 (3.9 1000 NG / 잘 코르티 코스 테론 제로) 직렬 희석 기준의 200 μl를 스파이크SM (1:20)] 및 EIA 분석 플롯 다음 섹션 3과 EIA에서 실행 관측 된 농도 - 예상 농도 대 배경 (제로 샘플의 농도). 주 : 표준 희석 풀링 분변 추출물의 첨가가 유의 양 예상 선형 회귀 결과를 변경하지 않으면 R이&gt; 0.90, 1.0 및 p &lt;0.05에 가까운 기울기를 산출한다. 환경 영향 평가와 간섭을 달성 없습니다. </li></ol></li><li> 생물 유효성 검사 : 참고 : 선택한 EIA 관심 호르몬의 생물학적으로 중요한 변화를 측정 할 수있는 능력이있는 데모 [예는, 약리학 다음 글루코 코르티코이드 농도의 상승 또는 생물학적 도전 (ACTH가 종종 허가 절차) (예를 들어, 심리적 및 / 또는 환경, 기회주의 관계가없는 이벤트가 될 가능성이 더 높습니다)]. <ol><li> 선택 추출물과 글루코 코르티코이드 대사 산물 농도에 대한 분변 샘플을 분석이전과 도전 이벤트 - 3 절에서 1 설명 된 프로세스를 사용하여. 주 : 도전 이벤트가 특정 종 수 있습니다. 예시적인 방법은 국내 말은 아래 제공된다. 말에 대한 도전 이벤트의 전체 예는 관리 9 축산 절차 (16)의 사용을 포함하여 이전에 발표되었다. 도전 이벤트 다음 글루코 코르티코이드의 대사 산물 농도의 유의 한 증가가 관찰 및 통계 분석을 사용하여 확인해야합니다. 이것은 반복 측정 샘플 날짜 및 개인의 영향을 적절 포함한다. 생물학적 검증은 달성 된 것으로 간주된다. </li></ol></li></ol>

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R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. 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J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+stress+in+wildlife:+techniques+for+quantifying+glucocorticoids.">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li><li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species.">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li><li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds:+the+importance+of+validation.">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li><li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research:+considerations+for+application+and+interpretation.">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

분변 코르티 분석 말 부신 활성의 장기 패턴을 평가하는 수단을 제공한다. 상기 방법의 비 침습적 자연 타액 플라즈마 분석 9 포함한 부신 활성을 평가하기 위해 사용되는 다른 샘플링 방법의 교란 효과를 극복한다. 또한이 기술은 무료에 이르기까지 말을 공부하는 경우 명확한 비 침습적 인 장점이 있습니다. 이 방법의 적절한 사용에 관한 논의하기 위해 몇 가지 주?...

방법 설명 목적은 부신 활성의 비 침습적 평가를 제공하기 위해서 말 대변 코르티 코스 농도를 분석한다. 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축 활동을 측정하는 것은 포로 및 국내 종 모두에서 잠재적으로 혐오 상황에 대한 반응을 연구하는 허용 방법입니다. 참조 기술과 가장 널리 사용되는 방법은 그러나, 배설물 분석과 같은 다른 방법이없는 범위 종을 감시하는 기능을 채혈 자체에 의해 유도 된 응력을 극복 할 수 있도록하기 위해 개발 된 혈장 (1)의 사용이다. 혐오 상황시, 생리적 항상성이 파괴된다. 앞쪽에 뇌하수체에 작용하여 부 신피질 자극 호르몬 (ACTH)의 방출을 자극 방출 호르몬 (CRH)를 corticotrophin 뇌 릴리스의 시상 하부. ACTH는 혈류를 입력하고 종을 분비하는 부신 피질을 자극s의 특정 글루코 코르티코이드 (GC). 글루코 코르티코이드는 밀접하지 않고 지속적으로 그러므로 그들은 종종 다른 스트레스 링크 호르몬이 이상 환경에서 측정 된 모든 에너지를 높게 한 상태에서 생산되고보다 스트레스가 이벤트에 연결되어 있습니다. 글루코 코르티코이드는 말을 여러 적응 효과에 대한 책임이 있습니다. 에너지가 급속 지방산 및 글루코스의 형태로 본문에 저장 사이트로부터 동원되는 산소 섭취량은 감각 기능 3을 향상 혈류가 이동 4 불필요 영역 감소, 증가된다. 뿐만 아니라 대응 메커니즘으로 작용하는 글루코 코르티코이드에 의한 응력 상승은 다음 스트레스 5 동물을 제조하는 데 도움이된다. 호르몬 혈장 수준과 침을 평가하는 것은 배설물 대책 호르몬의 대사 최종 제품 대사를 측정하지만 실제 순환 호르몬을 측정하는 것을 포함한다. 순환 스테로이드는 리터에 이화된다그들은 장 트랙 6에서 세균성 식물의 효소 활성에 의해 촉진 추가 변경을 거쳐 담즙에 배설하기 전에 이베. 따라서, 혈중 글루코 코르티코이드 지향 면역은 배설물 글루코 코르티코이드의 대사 산물 (7)의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 찌끼 모음 말 아무런 방해하여 수행 될 수있는 바와 같이, 코르티 대한 대변의 분석은 다수의 환경에서 HPA 활동을 모니터링하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 말의 배설물에 상승 코르티 코스 테론은 수술 후 의학적 치료 8시 제한적 하우징 (9)을 포함하여 잠재적 인 혐오 상황에 대한 응답으로보고되었다. 대변 ​​샘플링은 시간이 지남에 풀링 된 글루코 코르티코이드 수준보다는 장기, 만성 또는 계절 패턴 (10)을 모니터링하기위한 적절하고 혈장과 타액에서 제공하는 시간 샘플링에있는 점을 반영한다. 때문에 비 침습적으로방법의 본질은, 샘플 캡처하거나 구속 11 없이도 개인 반복적으로 수집 될 수있다. 샘플링 프로토콜을 계획 할 때, 종 특정 장내 통과 시간이 고려되어야한다. 말에서 소화관 통과 시간 따라서, 부신 반응과 후속 코르티 대사는 HPA 축의 활성화 후 초기 언젠가 대변 검출 할 수 약 18 내지 12 시간이다. 비 침습적 면역 기술을 활용하면 조사중인 종에 대한주의 깊은 검증이 13 필수적이다. 또한, 호르몬 대사 산물의 배설에 성별 차이로 인해 신진 대사 속도와 마우스 (14), 닭 (15) 등 다양한 종으로 배설 코르티 코스 테론의 대사 산물의 종류의 차이에 아마보고되었다. 일에 자세히 설명되어 있습니다로는 분석이 남성과 여성의 국내 말 모두에 사용하기 위해 검증 된이 방법의 일환으로, 따라서 중요전자 프로토콜입니다. 남녀 간의 호르몬 대사의 차이는 해결하지 않고 분석 검증의 일부로 포함 거의되어 아직 데이터 품질에 대한 처벌을 받게됩니다. 이 비 침습적 방법은 국내 말에 부신 활동의 장기 평가를 할 수 있습니다. 프로토콜 세부 분석의 검증 및 분석 기술 자체를 모두.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corticosterone antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50-23-7</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15087-01-1</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77-92-9</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30931-67-0</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332732B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 7</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332742D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332762H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BFS-525-010A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer +printer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fridge-freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flammable liquid storagecabinet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>649-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume cupboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot-plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>640-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate washer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#174; pipettes - multipack option 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 1000ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 200ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 20ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Progen Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Hilsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

국내 말 (N = 16, 8 암말, 8 geldings) 십오년 (± 3)의 평균 연령은 성별과 사회적 고립 (N = 4 말 / 치료)의 증가 수준 4 개의 주택 디자인 대상에 따라 분류 하였다. 밀접하게 그들의 자연 서식지를 시뮬레이션, 무리 환경에서 생활 주택 1 관련된 말. 실내 헛간에 쌍에 살고있는 주택이 포함 된 말. 하우징 (3) 참여 말은 마구간에 있지만, 다른 말과 말의 하우징 (4) 관련 총 격리 시각?...

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

fecal-glucocorticoid-analysis-non-invasive-adrenal-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K 조회수.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

비디오: Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

마우스 부신 Chromaffin 셀 절연

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

연구

생물학

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

싱크로 트론 - X - 레이 - tomography를 사용하여 서브 마이크론 해상도로 비침습 3D - 시각화

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal welfare guidelines, non-invasive techniques should be preferred whenever applicable. In our group, we work on different species of song birds in the lab and in the field, and we successfully apply non-invasive methods to sex and individually mark chicks. This paper presents a comprehensive non-invasive tool-box. Sexing birds prior to the expression of secondary sexual traits requires the collection of DNA-bearing material for PCR. We established a quick and easy method to sex birds of any age (post hatching) by extracting DNA from buccal swabs. Results can be obtained within 3 hours. For individual marking chick's down feathers are trimmed in specific patterns allowing fast identification within the hatching order. This set of methods is easily applicable in a standard equipped lab and especially suitable for working in the field as no special equipment is required for sampling and storage. Handling of chicks is minimized and marking and sexing techniques are non-invasive thereby supporting the RRR-principle of animal welfare guidelines.

This protocol provides a convenient set of methods, which enables extremely fast, easy, non-invasive, reliable and low-cost, molecular sex determination of birds and their non-invasive, quick, safe and easily recognizable marking shortly after hatching. Only limited handling of chicks is required. This convenient toolbox of methods complies entirely with the RRR-guidelines.

누구는 누구입니까? 비 침습적 인 방법 개별적으로 섹스와 마크 Altricial 병아리

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

대변 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

요약

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