우리는이 연구에서 분석 사람의 모발 샘플을 제공 Kymberlee 오브라이언, 셀리아 무어, 에드워드 Tronick 씨 (심리학과, 매사 추세 츠, 보스턴 대학교) 감사, 스티븐 개가 아만다 D​​ettmer (비교 행동학, NICHD의 실험)에 대한 붉은 털 원숭이의 머리 샘플을 제공한다. 초기 개발 및이 방법을 계속 사용 MAN에 NIH RR11122에 의해 지원 된

1. 시료 채취 및 보관 <ol><li> 사람의 모발 <ol><li> 고무 밴드 나 클립 (직경 연필 폭까지) 샘플링 할 수있는 머리의 전체 길이를 고정합니다. 최대한 두피에 가깝게 잘라 머리 깨끗한 가위 (닉은 피부를 돌보는). 주 : 표준 샘플링 에리어가 두개골의 후방 정점이다. </li><li> 일부 연구자들은 비록 볼 Manenschijn 등. 8 (물과 샴푸 7 반복 노출에서 유실로 인해 수 있습니다 두피 6에서 거리를 가진 사람의 모발의 CORT 수준의 감소를보고 반하는 결과를 톰슨 등. 9있다 더 분절 하락이 잠재적 인 &quot;유실 효과&quot;의 영향을 최소화하기 위해) 관찰 된, 우리는 1cm / 월 (10)의 평균 성장률을 가정 3cm (,보다 더 큰 길이 두피에 인접 머리 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다 3cm 세그먼트는 C를 포함약 지난 3 개월 동안 퇴적 된 ORT). 이 작업을 수행하려면 첫 번째 컷에서 3cm를 측정하고 3cm 샘플을 얻을 다시 잘라 통치자를 사용합니다. 참고 : 머리 길이로 절단되면,이 연구는 이전의 샘플링 기간 동안 CORT 증착의 회고 일정을 설정하는 별도의 1cm 긴 세그먼트로 샘플을 절단 포함하지 않는 정렬 가닥을 유지하기 위해 더 이상 필요 6. </li><li> 알루미늄 호일, 깨끗한 종이 봉투, 또는 샘플 세척에 사용되는 유형의 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. CORT 모발이 매우 안정되어 필요한 경우, 시료는 주위 온도에서 밤새 발송, -20 ° C에서 무기한으로 저장 될 수있다. </li><li> 머리 수집 절차는 자원 봉사자에 연습을해야하고 연습 샘플은 전체 연구에 착수하기 전에 고려되어야한다. 참고 : SMA로 머리 샘플을그것은 낮은 CORT 표준 이하 EIA 판독을 얻는 가능성을 최소화하기 위해 샘플을&gt; 10 ㎎을 수집하는 것이 바람직하지만 LL 5-10 MG로서, 여기에 기술 된 방법을 사용하여 분석 할 수있다. </li></ol></li><li> 원숭이 머리 <ol><li> 표준 동물 클리퍼를 사용하여 목의 목덜미에서 머리 (100 ~ 250 mg)을 면도. 가능한 한 피부에 가까운 면도 피부가 닉에주의하면서 혈액 CORT 수준이 머리에있는 사람에 비해 매우 높기 때문에 출혈의 원인이됩니다. 참고 : 일반적으로 머리의 좋은 소스와 쉽게 이전 리샘플링에 머리 재성장을 관찰 할 수 있기 때문에 목 부분이 일상적인 샘플링을 위해 선택되었다. </li><li> 알루미늄 호일 또는 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. 원숭이 머리 샘플을 저장하고 사람의 모발 샘플에 대해 전술 한 바와 같이 동일한 방식으로 발송한다. </li><li> 원숭이 머리, 사람의 두피 모발과는 달리, 세인트 다음 특정 길이로 성장하고 있기 때문에(11)을 성장 본부, 그것은 CORT 증착 달력으로 피부로부터의 거리를 사용하는 것,이 경우 일반적으로 가능하지 않다. 동물 추가 (주기적 루틴 건강 시험 동안, 예를 들어) 번 이상을 샘플링 할 수있는 경우에는 그 기준 시점을 설정하고, 원하는 시간 기간이 경과 한 후에 동일한 면적 reshave하는 초기 면도를 수행하는 것이 바람직하다. 두 번째 샘플에 CORT는 그 간격을 5 이상 HPA 활동에 샘플의 CORT 내용의 정확한 원인 규명을 허용하는 면도-reshave 간격 동안에 퇴적되었다. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 세탁 및 건조 <ol><li> 세탁 <ol><li> 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브에 각 머리 샘플을 놓습니다. </li><li> 회 전자를 사용하여 3 분 동안 반복 반전이어서 각 튜브에 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)상의 이소프로판올 5 ㎖를 추가. </li><li> C를 복용, 폐기물 용기에 이소프로판올을 가만히 따르다샘플 중 하나를 잃을 수 없습니다. </li><li> 반복 2.1.2과 2.1.3 번 더 반복합니다. </li></ol></li><li> 건조 <ol><li> 전체 이소프로판올 증발을 보장하기 위해 최소 2 ~ 3 일 머리를 건조. </li></ol></li></ol> 3. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 큰 샘플을위한 방법 1 <ol><li> 샘플 연삭 <ol><li> 스테인레스 스틸은 하나의 12mm 스테인레스 스틸 연마 공 함께 항아리 연삭 10 ㎖에 말린 머리카락의 250 밀리그램까지 넣습니다. </li><li> 볼 밀을 사용하여 25 ㎐의 속도로 6 분 동안 샘플을 분쇄. </li><li> 분석 저울 가루 머리의 50 밀리그램까지 달아 후속 CORT 추출을 위해 깨끗하고 2.0 ㎖의 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 관에 전송합니다. </li></ol></li><li> CORT 추출 <ol><li> 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.0 ML를 추가합니다. </li><li> 관 모자와 공동 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어회 전자를 사용하여 nstant 반전. </li><li> 가루 모발 펠렛을 실온에서 1 분 동안 14,000 rpm에서 원심 분리 튜브. </li><li> 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 0.6 ML을 전송합니다. </li></ol></li></ol> 4. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 작은 샘플에 대한 방법 2 <ol><li> 샘플 연삭 <ol><li> 구슬 구타를위한 강화 된 preweighed 2 ㎖ microcentrifuge 관에 머리의 60 밀리그램까지 넣습니다. </li><li> 샘플 중량을 구하는 바이알을 닫고 다시 무게를 측정한다. </li><li> 각각의 병에 세 3.2 mm 크롬 강철 구슬을 추가 한 다음 비드 비터 적어도 2 분 동안 샘플을 갈기. 육안 검사는 시료가 충분히 분쇄 것을 알 경우, 0.5 또는 1 분 동안 추가로 연삭을 수행합니다. 참고 : CORT 추출은 연삭과 같은 바이알에서 수행되기 때문에 접지 머리 관련 전달이 경우에는 필요하지 않다. </li></ol&gt; </li><li> CORT 추출 <ol><li> 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 튜브를 모자와 회 전자를 사용하여 일정한 반전과 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어. </li><li> 가루 모발 펠렛을 실온에서 5 분 동안 10,000 rpm에서 원심 분리 튜브. 참고 : 크롬 강철 구슬 방법 1에 비해 낮은 원심 분리 속도를 차지하고있는, 추출 및 원심 분리 단계에서 머리와 튜브에 남아 있습니다. </li><li> 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 1.0 ML을 전송합니다. </li></ol></li></ol> 5. 용매 증발 및 샘플의 재구성 <ol><li> 진공 증착을 사용할 수없는 경우에는 진공 증착이나 질소 가스 스트림을 사용하여 메탄올을 말린다. 진공 증착 장치를 사용하는 경우, 메탄올은 수증기에 의해 포획 될 수있다콜드 트랩이나 활성탄 카트리지 탑재 화학 트랩. </li><li> 메탄올의 제거 후, ​​EIA 분석 버퍼 (분석 희석제)의 적절한 볼륨 CORT 추출물을 재구성. 비교적 높은 CORT 값이 예상되는 경우, 0.4 밀리리터 이상의 버퍼 볼륨을 사용한다. 비교적 낮은 값이 예상되는 경우, 볼륨 감도를 높이기 위해 0.2 밀리리터 이하로 감소 될 수있다. 참고 : 0.2 ㎖에 시료의 재방송이 필요한 경우에 최소한 두 번 샘플의 중복 분주을 실행하기에 충분한 양이다. </li><li> 즉시 재구성 샘플을 분석 실험 이후 분석을 위해 -20 ° C에서 그것을 동결​​ 하나. 주 : 재구성 된 샘플을 냉동 경우, 샘플 볼륨 변경 이후 동결 기간 동안 승화을 방지하기 위해 중요한 것은 최종 계산이 수행되는 거짓 CORT 값으로 이어질 것입니다. </li></ol> 6. CORT 분석 및 데이터 변환 <ol><li> 를 머리 추출물을 분석CORT은 고감도 효소 면역 측정법 (EIA) 키트를 사용. 참고 : 시료 중복 각 재구성 헤어 추출물의 분주 대신 타액됩니다 것을 제외 키트 삽입에 지정된 CORT EIA 키트 상업 타액을 사용하는 경우, 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 모든 분석에서 사용하기위한 품질 관리 (QC)의 머리에 키스를 준비합니다. <ol><li> 여분의 모발 샘플 개수를 수집하고 어느 단계 4.1 및 4.2 단계 3.1 및 3.2에있는 큰 샘플 처리를 풀 같이 개별적으로 처리합니다. </li><li> 용매를 증발시키고, 단계 5.1 및 5.2에서와 같이 추출물을 재구성하고 여러 개의 개별 또는 합동 샘플에서 재구성 된 추출물을 풀. </li><li> 개별 마이크로 원심 튜브에 모아 재구성 추출물 (예를 들어, 0.10 ㎖)의 적절한 볼륨을 나누어지는하고 나중에 사용하기 위해 냉동. </li><li> 해동 및 REFE를 제공하기 위해 각 면역 마이크로에 중복 한 QC 나누어지는 실행각 런의 품질 검사를 위해 CORT 값 rence. </li><li> 변동 (CV; 샘플 값의 집합의 평균으로 나눈 표준 편차로 정의)의 인트라 분석 계수는 분석 간 CV가 계산 될 수있는 반면, 동일한 런 10-12 QC 웰을 분석하여 산출 할 수있다 런 그룹 걸쳐 QC 값을 사용. 하나의 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어가 각 머리 추출물을 나타내는 중복 웰 대해 CV를 계산하면, 다음 인트라 분석 CV를 결정하기위한 다른 방법은, 전체 판에 걸쳐 그 각각의 CV 값의 평균값을 계산하는 것이다. </li><li> 모든 시료 추출물 EIA에서 가장 높은 CORT 표준보다 읽고 더를 산출하면, 추출물의 또 다른 분취 액을 분석 완충액의 적당량으로 희석하고 후속 EIA 판독은 희석 계수에 대해 보정된다. 중복 우물 CV가&gt; 10 % 인 경우 샘플은 또한 정기적으로 다시 분석된다. </li><li> CORT EIA 키트는 CORT VA를 측정하도록 설계되어 있기 때문에매독 타액이나 플라즈마 등의 액체 샘플에서, 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어의 출력은 분말 머리의 단위 중량 당 CORT의 양으로 변환해야합니다. 다음 수식은 MG 머리 당 PG의 CORT에 ㎍ / DL에서 분석 출력을 변환합니다 : (A / B) * (C / D) * E * 10000 = F 여기서 분석 출력에서​​ A = ㎍ / DL, 추출하고, 머리의 B = 체중 (밀리그램), C = 권. 메탄올 (ml의)는 분말 머리에 추가, D = 권. 추출물에서 발견 한 이후에 아래로 건조 메탄올 (ml 중), E = 권. 건조 된 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼 (ML에) 및 PG / MG 헤어 CORT 농도의 F는 = 최종 값. </li></ol></li></ol>

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	<li>Selye, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+the+general+adaptation+syndrome.">Stress and the general adaptation syndrome.</a> Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Hair+cortisol:+A+novel+biomarker+of+hypothalamic-+pituitary-adrenocortical+activity.">Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+neurochemistry+of+self-injurious+behavior:+A+nonhuman+primate+model.">The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model.</a> Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).</li><li>Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+monkey+model+of+self+injury:+Effects+of+relocation+stress+on+behavior+and+neuroendocrine+function.">A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function.</a> Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).</li><li>Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+as+a+retrospective+calendar+of+cortisol+production+-+Increased+cortisol+incorporation+into+hair+in+the+third+trimester+of+pregnancy.">Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).</li><li>Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shampoo+and+water+washing+on+hair+cortisol+concentrations.">Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations.</a> Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).</li><li>Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+method+to+measure+long+term+cortisol+levels.">Evaluation of a method to measure long term cortisol levels.</a> Steroids. 76, 1032-1036 (2011).</li><li>Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+provides+a+historical+record+of+cortisol+levels+in+Cushing&#8217;s+syndrome.">Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing&#8217;s syndrome.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).</li><li>LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variations+in+growth+rate+and+sample+collection+on+interpreting+results+of+segmental+analyses+of+hair.">The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair.</a> Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).</li><li>Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+hair+growth+in+Macaca+mulatta.">Variability of hair growth in Macaca mulatta.</a> Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).</li><li>Sauv&#233;, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cortisol+in+human+hair+as+a+biomarker+of+systemic+exposure.">Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure.</a> Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).</li><li>Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+cortisol+analysis+in+hair+and+its+clinical+applications.">An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications.</a> Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).</li><li>Bechsh&#248;ft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+levels+in+hair+of+East+Greenland+polar+bears.">Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears.</a> Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).</li><li>Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Society+of+Hair+Testing+guidelines+for+drug+testing+in+hair.">Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair.</a> Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).</li><li>Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+follicles+display+a+functional+equivalent+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+(HPA)+axis+and+synthesize+cortisol.">Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol.</a> FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).</li><li>Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol+as+a+biological+marker+of+chronic+stress:+Current+status,+future+directions+and+unanswered+questions.">Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions.</a> Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).</li><li>Stalder, T., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cortisol+in+hair+-+State+of+the+art+and+future+directions.">Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions.</a> Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li><li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol,+stress+exposure,+and+mental+health+in+humans:+A+systematic+review.">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li></ol>

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전술 한 헤어 CORT 절차 수행하도록 심플 상대적으로 저렴하고, 쉽게 이용할 화학 시약 및 소모품의 사용을하게하고, 한 가지 예외 전형적인 분석 실험실에 존재할 가능성이 있다고, 장비를 필요로한다. 예외는 볼밀 미니 beadbeater 같은 연마 장치이다. 우리는 몇 가지 연구 그룹은 작은 조각 길이 12 대략 1mm에 머리 샘플을 말하다 있습니다,하지만 우리는 연삭 수행하는 대신 가능하면 닦지 ?...

혈장, 타액, 또는 때때로 소변이나 대변의 CORT 측정 스트레스 1 HPA 축의 역할 Selye 디스커버리시기 생리적 스트레스의 지표로서 사용되었다. 수많은 논문이 급성 스트레스 상황에 HPA 활동과 관련된 발행되었지만, 필드는 만성 생리적 스트레스 간단하고 신뢰성 지수의 부족에 의해 방해되었다. 이 문제가 발생주기 차이가있을 수있는 환경 교란에 의해 혼동 될 수 HPA 활동의 플라즈마 침 수율 모두 &quot;포인트&quot;예상하기 때문이다. 오줌과 배설물 샘플 어떤 경우에는 하루 종일까지 시간의 숫자에 걸쳐 CORT 및 / 또는 대사 산물의 배설의 측정 값을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 HPA 활성의 진정한 장기 인덱스 및이 싸이의 응답 성을 제공하지 않는다; 이러한 행렬들의 임의 시간 경과 CORT 레벨의 거친 지수를 제공 할 수있다하여 여러 샘플의 컬렉션만성 스트레스에 줄기. 머리에 CORT를 측정하는 것은 스트레스 문학이 중요한 필요를 채우기 위해 시작했다. 여러 실험실에 의한 초기 연구는 인간의 머리에 CORT의 존재를 증명하지만, 머리 CORT 수준이 스트레스 2의 함수로 변경 여부를 조사하지 않았다. 우리 연구실은 다양한 사회 및 행동 요인 (3)에 의해 붉은 털 원숭이 HPA 축 조절에 몇 년 동안 관심이있다, 우리는 붉은 털 원숭이 머리 4의 추출 및 분석을위한 방법을 설정하고 확인하기 위해 밖으로 설정합니다. 혈액 유래 CORT 천천히 연속적으로 성장하는 모발에 혼입되는 것을 전제로,이 새로운 방법의 목적은 개월 주내 걸쳐서 HPA 활성의 통합 지표로서 헤어 유래 CORT 수준을 사용하는 것이었다. 몇 가지 방법 론적 문제는 본 프로토콜 개발에 발견되었습니다. 첫째, 이전의 연구는 적은 양의 O를 표시했다F 땀과 피지에 배설 CORT을 순환하기 때문에 코트 머리 축 (2)의 외부를 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 혼동을 제거하기 위해, 우리는 성장 모간 내에 존재 CORT에 최소한의 효과를 가지면서 외부 CORT 제거 나타나는 온화한 세척 과정을 개발 하였다. 따라서,이 절차 (이소프로판올, 즉 두 개의 3 분 세척) 실시 원숭이 머리 전체 머리 CORT 내용의 약 ~ 8 %를 손실 및 제 3 세척 샘플 4에서 1 % 미만의 더 많은 스테로이드를 제거했습니다. 같은 절차 (게시되지 않은 K. 로젠버그와 J. 마이어) 샘플에서 27 % 총 CORT 콘텐츠의 평균을 제거하기 때문에, 사람의 모발에 더 많은 외부 CORT이있을 나타납니다. 원숭이 머리를 좋아하지만, 추가 세척은 처음 두 세척보다 훨씬 적은 CORT (약 7 %)가 포함되어 있습니다. 따라서, 원숭이 및 사람의 모발 양의 결과가 주요 골절을 유지하면서, 대부분 (전부는 아니더라도) 외부 CORT가 제거 될 수 있다는 논쟁을 지원내부 헤어 매트릭스 내에서 CORT의 기. 둘째, 우리의 파일럿 연구는 또한 보여 주었다 아마도 모간의 복합 단백질 성 매트릭스를 오픈 침입뿐만 아니라 용매의 침투 가능한 표면 면적을 증가시킴으로써, 샘플에서 유의하게 증가 COR​​T 회수를 추출하여 모발 전에 연삭. 두 개의 서로 다른 연삭 방법은 장점과 단점을 각각 개발되었다. 볼 밀을 사용하여 방법 1, 각종 분말을 제조하는 장점을 갖는다. 그러나, 볼 밀은 비교적 고가의 장비 아이템이며 표준 연삭 항아리와 볼을 사용하는 경우, 한 번에 두 개의 시료를 분쇄 할 수있다. 작은 샘플도 표준 연삭 항아리와 볼 밀을 사용하여 처리하기가 어렵습니다. beadbeater을 사용하는 방법 2, 그것의 분쇄 능력에 덜 효과​​적이다. 결과적으로, 보통 CORT 복구는 볼밀 (미공개 데이터)와 비교하여이 방법을 사용하여 약 10 % 낮다. 한편, beadbeater상당히 저렴 볼밀보다, 16-24 번 샘플은 모델에 따라에서 접지 될 수 있고, 상기 방법은 작은 샘플에 매우 적합하다. 때문에 상기 차동 회복, 그것은 특정 연구 내 모든 샘플에 대해 동일한 연삭 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 모발 샘플을 처리 한 후, 그들은 원래 타액 CORT을 측정하기위한 민감하고 특정 상용 EIA 키트에 의해 분석된다 추출한 메탄올 CORT로 추출된다. 추출 및 분석 절차는 원숭이의 머리 샘플에서 추출의 시리얼 희석 밀접 본격적인 CORT 표준에서 얻은 측정 값을 병렬 EIA 수치를 산출 시연에 의해 부분적으로 확인되었다. 우리는 그 (플라즈마 및 타액 CORT) 외에도 헤어 CORT 새로운 주택 분기 4,5 원숭이의 관리 상 의무 재배치의 주요 생활 스트레스에 민감한 것으로 나타났다. 프리젠T 종이는 인간과 원숭이의 머리 샘플을 처리하고 이러한 샘플에서 CORT를 추출하고 분석하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 방법에 대한 자세한 계정을 제공합니다.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

스트레스 호르몬 코르티솔 (CORT)은 서서히 인간, 비인간 영장류, 그리고 다른 포유 동물의 성장 머리 샤프트​​에 통합됩니다. 우리는 개발과 검증 된 붉은 털 원숭이의 머리에서 CORT 추출 및 분석하는 방법을 연속적으로 인간의 두피 모발에 사용하기 위해이 방법을 적용. 플라즈마 또는 침에서 얻은 CORT &quot;포인트 샘플&quot;대조적으로, 머리 CORT 호르몬 결합의 기간 동안, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부 신피질 (HPA) 시스템 활동의 통합 측정, 따라서 생리적 인 스트레스를 제공합니다. 사람의 두피에 머리가 1cm / 월의 평균 속도로 성장하고 있기 때문에, 머리 부분에서 얻은 CORT 수준의 길이는 몇 cm 잠재적 개월 수에 대한 경험이 스트레스의 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다. 우리의 방법에서, 각 모발 샘플은 제 땀과 피지에서 증착 된 머리 샤프트​​의 외부로부터 어떠한 CORT 제거 이소프로판올에 두 번 세척한다. 건조 후,샘플은 모발 단백질의 행렬을 분해 및 추출을위한 표면적을 증가시키는 미세 분말로 분쇄된다. 모간의 내부로부터 CORT 메탄올로 추출하고, 메탄올을 증류 제거하고, 추출액을 분석 완충액에서 재구성된다. 추출 CORT, 표준 및 품질 관리와 함께, 다음 민감하고 특정 시판 효소 면역 측정법 (EIA) 도구에 의해 분석된다. EIA의 판독은 MG 분말 머리 무게 당 PG의 CORT으로 변환됩니다. 이 방법은 인간의 머리 CORT을 분석하기 위해 실험실에서 사용 된, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이, 개, 그리고 북극곰의 몇몇 종. 우리가 실험실에서와 다른 연구 그룹 모두에서 많은 연구가 자연에 만성 스트레스에 노출을 평가뿐만 아니라 실험실 설정에 대한 머리 CORT의 광범위한 적용 가능성을 증명하고있다.

그림 1은 방법 2 분쇄 및 추출을 사용하여 처리 사람의 모발 샘플 (성인 남성과 여성의 인체)의 대표 세트의 출력을 보여줍니다. 컴퓨터 소프트웨어는 데이터 출력을 생성하고 CORT 표준에 4 - 파라미터 S 자형 곡선 (도 2)을 맞추기 위해 사용되었다. 이 판의 사이에 잘​​ CVS는 0.01-5.73 %에서 1.34 %의 평균 내부 분석 CV와 함께였다. 분석 간 CV는 4.41 % 아홉 최근 인간의 머리카락...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.

추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

extraction-and-analysis-of-cortisol-from-human-and-monkey-hair

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K 조회수.  University of Massachusetts, Amherst.  코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Internal organs such as the heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for their normal functions1. Motile cilia are involved in establishing LR asymmetry in vertebrate embryos, including mouse, frog, and zebrafish2-6. These 'LR cilia' generate asymmetric fluid flow that is necessary to trigger a conserved asymmetric Nodal (TGF-&beta; superfamily) signaling cascade in the left lateral plate mesoderm, which is thought to provide LR patterning information for developing organs7. Thus, to understand mechanisms underlying LR patterning, it is essential to identify genes that regulate the organization of LR ciliated cells, the motility and length of LR cilia and their ability to generate robust asymmetric flow.
In the zebrafish embryo, LR cilia are located in Kupffer's vesicle (KV)2,4,5. KV is comprised of a single layer of monociliated epithelial cells that enclose a fluid-filled lumen. Fate mapping has shown that KV is derived from a group of ~20-30 cells known as dorsal forerunner cells (DFCs) that migrate at the dorsal blastoderm margin during epiboly stages8,9. During early somite stages, DFCs cluster and differentiate into ciliated epithelial cells to form KV in the tailbud of the embryo10,11. The ability to identify and track DFCs&mdash;in combination with optical transparency and rapid development of the zebrafish embryo&mdash;make zebrafish KV an excellent model system to study LR ciliated cells.
Interestingly, progenitors of the DFC/KV cell lineage retain cytoplasmic bridges between the yolk cell up to 4 hr post-fertilization (hpf), whereas cytoplasmic bridges between the yolk cell and other embryonic cells close after 2 hpf8. Taking advantage of these cytoplasmic bridges, we developed a stage-specific injection strategy to deliver morpholino oligonucleotides (MO) exclusively to DFCs and knockdown the function of a targeted gene in these cells12. This technique creates chimeric embryos in which gene function is knocked down in the DFC/KV lineage developing in the context of a wild-type embryo. To analyze asymmetric fluid flow in KV, we inject fluorescent microbeads into the KV lumen and record bead movement using videomicroscopy2. Fluid flow is easily visualized and can be quantified by tracking bead displacement over time.
Here, using the stage-specific DFC-targeted gene knockdown technique and injection of fluorescent microbeads into KV to visualize flow, we present a protocol that provides an effective approach to characterize the role of a particular gene during KV development and function.

Cilia-generated fluid flow in Kupffer&#x2019;s Vesicle (KV) controls left-right patterning of the zebrafish embryo. Here, we describe a technique to modulate gene function specifically in KV cells. In addition, we show how to deliver fluorescent beads into KV to visualize fluid flow.

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

그레이 스케일 분석을 사용하여 마우스의 탈모의 정량 분석​​을위한 새로운 기술

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

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