이것은 코알라 모피에서 글루코코르티코이드 호르몬, 코티솔의 평가를 위한 새로운 방법입니다. 그것은 코알라에서 만성 스트레스의 평가를위한 새로운 바이오 마커를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플 준비와 호르몬 분석 사이의 상당히 빠른 처리 시간을 가진 매우 민감하고 재현 가능한 방법입니다.
이 기술은 매우 유용한 임상 관리 도구인 코알라의 만성 스트레스의 정량적 평가를 허용합니다. 이 절차를 도와딜런 폭스, 내 실험실에서 대학원 학생입니다. 이 절차를 시작하려면 영하 80도에서 저장에서 모피를 검색하고 실온에서 해동할 수 있습니다.
그런 다음 실험실 분석 정밀 도면에 모피의 무게를 측정합니다. 60 밀리그램의 모피를 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 18개의 튜브가 채워질 때까지 반복합니다. 파이펫을 사용하여 각 튜브에 100%HPLC 등급 이소프로파놀1밀리리터를 추가합니다.
30초 동안 샘플을 소용돌이시다. 액체와 모피의 분리를 달성하기 위해 0.5 밀리리터 미세 정밀 체로 각 샘플을 변형하고, 폐기물 용기에 액체를 폐기. 각 모피 샘플을 라벨이 부착된 플라스틱 계량 보트에 넣습니다.
그런 다음 계량 보트를 진공 건조기에 넣고 3 일 동안 방치하여 털이 건조하게하십시오. 모피가 완전히 건조되면 각 샘플을 라벨이 부착된 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 샘플을 3개의 크롬 스틸 구슬이 있는 비드 밀에 놓고 초당 30쉐이크에서 2분간 분쇄합니다.
총 18개의 튜브가 채워질 때까지 100% 분석 등급 메탄올과 100% 분석 등급 이소프로판올로 이 전송을 반복하십시오. 그 후 파이펫을 사용하여 첫 번째 추출 기술의 1 밀리리터를 모피 샘플을 포함하는 6개의 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 각 튜브를 캡하고 셰이커를 사용하여 적어도 12 시간 동안 일정한 맥동으로 실온에서 배양하십시오.
그런 다음 0.5 밀리리터 미세 정밀체체로 샘플을 변형시. 파이펫을 사용하여 액체를 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 옮기면서 털이 적절하게 버려지도록 합니다. 연기 후드에서 질소 증기의 스트림 에서 용매 추출물을 완전히 시도하십시오.
그런 다음, 400 마이크로리터의 분석 완충제와 100% 분석 등급 에탄올의 100 마이크로리터로 건조 된 샘플을 재구성한다. 컨트롤을 만들려면 먼저 스트레스에 노출된 동물의 샘플을 선택합니다. 추출물 풀을 만들려면 각 샘플에서 20 마이크로리터의 추출물을 총 200마이크로리터가 얻을 때까지 섭취하십시오.
추출 풀을 영하 80도에 저장하여 에세이를 실행할 준비가 될 때까지 보관합니다. 준비되면 코티솔 표준에 대한 추출물에 대한 병렬 그래프로부터 30%및 70%바인딩 점에 대한 희석 계수를 얻고, 분석 버퍼를 사용하여 샘플 풀을 적절히 희석하여 높고 낮은 컨트롤을 만듭니다. 상용 코티솔 키트를 사용하여 공급업체의 지침에 따라 샘플, 컨트롤, 코티솔 표준, 비특이적 결합 유정 및 최대 결합 유정을 포함한 96웰 스트립 플레이트를 설치합니다.
키트 소책자에 포함된 플레이트 레이아웃 시트를 사용하여 샘플, 컨트롤 및 표준의 위치를 나열합니다. 다음으로, 100% 메탄올 추출 코알라 모피를 얻기 위해 이전에 설명된 모피 호르몬 추출 과정을 따르십시오. 제조업체의 지시에 따라 코티솔 키트의 시약을 준비하십시오.
파이프 50 샘플 또는 표준의 마이크로 리터 플레이트의 우물에. 피펫 75 마이크로리터의 분석 버퍼가 비특이적 결합 유정에 들어가고, 50마이크로리터의 분석 버퍼가 최대 결합 우물에 들어간다. 리피터 파이펫을 사용하여 각 웰에 코티솔 컨쥬게이트 25마이크로리터를 추가합니다.
이어서, 코티솔 항체의 파이펫 25 마이크로리터는 비특이적 결합 유정을 제외한 각 우물로 들어있다. 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 시약이 잘 혼합되었는지 확인합니다. 플레이트 실러로 플레이트를 덮고 궤도 셰이커를 사용하여 실온에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
그 후, 플레이트 씰을 제거하고, 300 마이크로리터의 세차완을 4번 으로 각각 잘 세척하여 웰 플레이트를 흡인한다. 그런 다음 깨끗한 흡수 성 수건에 두드려 접시를 건조시다. 각 우물에 테트라메틸벤지딘 기판의 파이펫 100 마이크로 리터.
플레이트 실러를 웰 플레이트에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 파이펫 50 마이크로리터의 스톱 용액을 각 우물에 넣습니다. 450 나노미터를 읽을 수있는 플레이트 리더로 플레이트를 전송하고 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 최종 호르몬 농도를 계산합니다.
이 연구에서는, 관심있는 호르몬 대사 산물의 에세이 검출은 병렬성을 사용하여 결정된다. 평행곡선에서 50%바인딩 점은 표준 곡선의 샘플 희석 계수를 결정합니다. 볼 수 있듯이, 100%에탄올 및 100%이소프로판올 추출물은 코티솔 표준에 대한 병렬 변위를 제공하지 않았다.
그러나, 100%메탄올 추출물은 코티솔 표준에 대한 병렬 변위를 제공한다. 변이의 인트라 및 인터 분석 계수는 모든 분석에서 실행되는 고결합 및 저결합 샘플 추출물로부터 결정됩니다. 바인딩이 낮은 내부 컨트롤은 깔끔한 코알라 추출물 풀로 보이며, 높은 바인딩내부 컨트롤은 1대 2 희석 코알라 추출물 풀로 보입니다.
각 용매 추출물과 코티솔 표준 사이의 연관성은 회귀 플롯을 사용하여 결정됩니다. 100% 메탄올 추출물은 100%에탄올 및 100%이소프로판올 추출물에 비해 가장 높은 R-제곱 값으로 가장 좋은 회귀 라인을 제공합니다. 스테로이드 호르몬의 손실을 피하기 위해 샘플을 연마 하기 전에 샘플 세척 단계를 수행 해야 한다는 것을 기억 하는 것이 중요 하다.
이 절차에 따라, 우리는 다른 스테로이드 호르몬을 측정할 수 있습니다., 코알라에서 스트레스와 재생 사이의 상호 작용을 보고 생식 호르몬 등. 이 기술은 코알라 모피에서 코티솔의 비 침습적 평가를 가능하게 하는 보존 생리학의 신흥 필드에 대한 새로운 도구를 제공합니다. 상업용 코티솔 키트는 시약을 분량으로 제공합니다.
그러나 이 실험실 절차를 수행하는 동안 자신에게 부상을 최소화하기 위해 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.
