이 프로토콜은 pupae 발달 중 다양한 시점에서 Drosophila에서 GFP 표지된 간접 비행 근육의 해부를 용이하게 하여 유전자 및 단백질 발현의 변화를 평가합니다. 이러한 기술을 사용하여 최소한의 RNA 단백질 분해를 갖춘 고농축 비행 근육 샘플을 달성할 수 있으며 RT-PCR, 서부 블롯 또는 오믹 접근법에 적합합니다. 이러한 특수 한 해부는 연습과 기술이 필요하지만 해부 할 수있는 강아지의 수와 샘플의 품질은 경험을 통해 향상시킵니다.
이 해분의 시각적 데모는 비 근육 조직으로부터 비행 근육을 구별하는 방법을 결정하고 pupal 표본에서 비행 근육의 신속한 격리를 촉진하는 데 중요합니다. 강아지를 무대에 올리기 위해 젖은 페인트 브러시를 사용하여 60mm 페트리 접시에 프리 푸파를 수집하고 옮기고 쌍안경 현미경으로 강아지를 성관계를 가십시오. 수컷은 고환의 존재에 의해 식별되며, 이는 불투명한 강아지에 반투명 글로브로 나타납니다.
파리의 시간, 날짜 및 유전자형으로 접시에 라벨을 붙인 후, 적절한 단계까지 25~27도의 섭씨 인큐베이터로 푸파에나이를 노화시다. 48 H APF 이전의 IFM 해부의 경우 젖은 페인트 브러시를 사용하여 적절하게 준비된 푸파를 차가운 PBS로 채워진 검은 색 해부 접시로 옮기십시오. 형광 해부 현미경에서, 검은 해부 접시의 바닥에 강아지 중 하나를 밀어 5 집게를 사용합니다.
pupae를 명확하게 시각화 할 수 있을 때까지 현미경 줌 및 초점을 조정합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 강아지의 전방을 파악하고 두 번째 한 쌍의 집게한 끝으로 새끼를 찌르고 복부의 약간 오프 센터, 흉부 바로 뒤에 있습니다. 첫 번째 포셉을 사용하여 푸팔 케이스의 전방 절반을 제거하고 흉부 바로 뒤에 노출된 새끼를 꼬집어 흉부에서 복부를 분리합니다.
다음으로 흉부의 전방 부분을 부드럽게 짜서 형광으로 표시된 IFM을 노출시합니다. 그런 다음, 집게를 사용하여 나머지 시체를 접시의 반대편에 버리고 후속 푸파를 동일한 방식으로 해부합니다. 모든 강아지가 해부되면, IPM 섬유를 수집하고 검은 해부 접시의 바닥에 더미로 섬유를 구성하기 위해 집게를 사용합니다.
집게를 사용하여 시야에서 파편을 밀어 내고 비IFM 근육, 지방, 큐티클 또는 샘플에서 원치 않는 조직을 제거하십시오. 그런 다음 클리핑 된 파이펫 팁을 사용하여 IFM 더미를 냉기 PBS 250 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 48 H APF 후 IFM 해부의 경우 가볍게 젖은 페인트 브러시를 사용하여 미세 스코프 슬라이드에 장착 된 양면 스티커 테이프 스트립으로 준비 된 푸파를 전달하십시오.
pupae를 선과 복부 측면 아래로, 앞쪽으로 슬라이드의 바닥쪽으로 방향을 지정합니다. 모든 강아지가 배치되었을 때, 포셉을 사용하여 앞쪽 첨탑 위에 첫 번째 pupal 케이스를 떼어 놓고 부드럽게 한 쌍의 포셉을 후방쪽으로 밀어 포스가 움직일 때 푸팔 케이스를 절단합니다. 열린 케이스에서 강아지를 풀어, 즉시 두 번째 현미경 슬라이드에 PBS의 드롭에 강아지를 전송.
모든 강아지가 풀려나면 미세 한 가위를 사용하여 흉부에서 강아지의 복부를 자르고 복부를 별도의 더미로 밀어 넣습니다. 모든 토축이 제거되면, PBS의 대부분과 복부더미를 제거하기 위해 티슈 페이퍼를 사용합니다. 남은 흉부에 신선하고 차가운 PBS 한 방울을 넣은 후 가위를 사용하여 세로 체축을 따라 머리에서 잘라 내어 흉부를 반으로 나눕니다.
모든 강아지가 해부되면 5 개의 포셉을 사용하여 중간 부분 중 하나를 선택하고 IFM의 중간 위와 아래에 하나의 포셉의 팁을 부드럽게 삽입하십시오. 여전히 집게의 첫 번째 쌍을 들고, 큐티클과 힘줄에서 IFM의 한쪽 끝을 잘라 미세 가위를 사용하여, pupae 180도 회전하기 전에, IFM의 다른 쪽 끝을 큐티클과 힘줄에서 무료로 절단 할 수 있도록. 집게를 사용하여 IFM 번들을 흉부에서 PBS 버블 가장자리로 전송하고 물 장력을 사용하여 번들을 제자리에 고정시하십시오.
그런 다음 시체를 슬라이드의 반대쪽으로 밀어 내고 나머지 IFM을 동일한 방식으로 해부합니다. 모든 IFM이 수집된 경우 5개의 집게를 사용하여 샘플로 들어갈 수 있는 점프 근육이나 큐티클 조각을 제거합니다. 그런 다음 물 장력을 사용하여 한 쌍의 집게 사이에 해부된 IFM을 부드럽게 캡처하고 IFM을 냉간 PBS 250 마이크로리터가 들어있는 1.5 밀리리터 미세 센심 분리 튜브에 배치합니다.
BRUNO1 IR IFMs의 mRNA 염기서열 분석 데이터는 야생형 염기서열 분석 데이터와 비교하여 유전자 단위 수준에서 발현의 변화를 나타낸다. 해부 된 IFM에 전체 프로테오메 질량 분광법을 사용하여, 유사한 조절은 단백질 과 단백질 동위원소 수준에서 관찰된다. Mhc의 최종 인트론으로 단백질 트랩 라인을 삽입한 후, GFP 표지 단백질의 통합은 90 H APF에서 M라인의 양쪽에 두 개의 점으로 IFM에서 관찰될 수 있으며, 다리 근육 조직에서GFP 신호는 sarcomere M 라인을 가로질러 균일하게 관찰될 수 있다.
해부 된 IFM에 RT-PCR를 사용하는 경우, MFP 라벨 엑슨 34에서 37 이벤트에서 라벨이 없는 엑슨 34 에서 35 이벤트로 Mhc 등색 스위치를 사용하면 27섭씨에서 푸파리움 형성 후 30~48시간 사이에 감지할 수 있습니다. mRNA 염기서열 분석 데이터에서 다리 및 점프 근육 조직은 세 가지 Mhc isoforms를 모두 표현하여 성숙한 근육에서 GFP 라벨이 부착된 등도포의 발현을 유지합니다. Spalt 주요 돌연변이및 BRUNO1 IR-IFM은, GFP 표지된 Mhc isoform의 발현을 그(것)들이 발전할 때, 다리와 점프 근육 조직의 그것과 유사한 등소형 발현 프로필의 결과로, 그 결과, 그(것)들을 중단하는 것을 실패했습니다.
해부는 RNA 분해를 방지하기 위해 30 분 이내에 수행되어야한다는 것을 기억하십시오. 그리고, 다른 세포 유형에 의한 오염을 제한하는 주의를 기울여야 한다. 이 방법은 RT-PCR 또는 서부 블로팅과 같은 생화학적 접근법에 적합한 IFM 농축 시료와 질량 분석법, 높은 처리량 시퀀싱, 크로마틴 형성 캡처 및 메타볼로믹스와 같은 오믹 스타일 접근법을 생성합니다.
이 해부는 개발 및 유전자 규제의 근본적인 기계장치를 조사하기 위한 시스템 수준 데이터로 Drosophila에 있는 강력한 유전 접근을 보완할 수 있습니다.
