The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

참고 : 살아있는 동물을 포함한 모든 절차는 EC 지침 6백9분의 86가 / EEC 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 지침과 지역 윤리위원회 (링거 Landesamt에 대 한 Lebensmittelsicherheit 싶게 Verbraucherschutz)의 승인에 따라 수행되었다. 티미 딘 유사체 1. 복강 내 주사 <ol><li> 주입하기 전에 동물에게 하루의 무게를. 다음 날뿐만 아니라, 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 중량 개별 조정 주입량에 계획된 모든 주사에 필요한 아날로그 티미 딘의 양을 계산한다. </li><li> 10 ㎎ / ㎖ 티미 딘 주식 솔루션을 준비합니다. (주의! 티미 딘 유사체 독성이. 화학 흄 후드를 사용, 즉, 공급 업체가 제공하는 특정 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 따라 실험실 코트와 장갑을 착용). <ol><li> 냉장고에서 티미 딘 아날로그를 타고 약, RT에 가져다. 21 ° C. 10 mg의 무게 추가0.04 N의 NaOH (BrdU의 및 CldU 용) 멸균 식염수 (멸균 식염수에, IDU)에, 소용돌이. 50 ° C의 물을 욕조와 소용돌이에 15 분마다 2 - - 분말을 용해 3 분을 적어도 10를 배치합니다. 참고 : 최대 24 시간 동안 사용 솔루션은 실온에서 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 때. 빛 (알루미늄 호일 커버)에서 솔루션을 보호합니다. 항상 침전물을 확인하고 필요한 경우 재용. </li></ol></li><li> 마우스 목덜미로 억제하고 복강 30 G 바늘 미세 투여 주사기를 사용하여 (RT시) 스톡 용액의 적절한 용적 중량 조정을 주입. 주 : CldU 경우와 IDU는 동일 동물에서 연속적으로 투여 될 필요가 등몰 농도를 주입 고려 (즉, 50 ㎎ / kg에 해당 BrdU의 42.5 ㎎ / kg CldU 57.5 ㎎ / kg IDU). 따라서, 그에 따라 10 ㎎ / ㎖의 원액을 주입 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 처리장관류 하루전 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 4 % 포름 알데히드 재. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 로 transcardially 40㎖를 빙냉 포름 알데히드 (유량 5 ㎖ / 분)에이어서, 10 ml의 빙냉 PBS로 좌심실을 통해 깊게 마취 된 쥐 (3.5 %의 이소 플루 란)을 관류. 4 ℃에서 24 시간 동안 동일한 정착액에 두뇌 및 사후 수정을 해부하다. </li><li> 연속적으로 10 % (4 ° C에서 24 시간)과 30 %의 자당 (뇌 싱크 때까지, 약. 48 시간)으로 뇌를 전송합니다. 기포가 조직에서 등장하지 않을 때까지 냉동, 천천히 -25 ° C의 이소 펜탄에 cryoprotected 두뇌 잠수함. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 냉동 마이크로톰에 40 μm의 두께의 관상 섹션 컷 (-25 블록의 온도를 -16 ° C). 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰을 함유하는 부동액 순차적으로 수수 부 (도 1 참조). -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol><img aLT = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot;/&gt; 24 웰 플레이트에 마이크로톰 조각을 전송 그림 1. 도식 그림. A1에서 시작 A6는 등 다음 행의 B로 이동 한 후, 행에 다음 조각을 배치합니다. D6에 도달 할 때, A1로 돌아가서 계속합니다. 조각의 이러한 배열은 전체 뇌의 부분 일 매 n의 정량화 수 있습니다. 신생아 세포의 정량 면역 표현형에 대한 (하나의 컬럼의 2 교대로 행의 내용에 해당) 매 12 번째 절을, (하나의 컬럼의 내용에 해당) 뇌 섹션 번째 매 6을. 3. 면역 염색 참고 : 섹션 6 웰 플레이트 캐리어 플레이트를 장착하고 삽입 메쉬 일반적으로, 무료로 부동 처리됩니다. 예외적으로, 항체 배양 및 ABC 반응은 메쉬 삽입 (w 당 0.5-1 ml의없이 12 또는 24 웰 플레이트에서 수행되는 블로킹엘)은 염색 할 필요가 슬라이스의 수에 따라, 충분하다. 이 단계 동안, 미세 브러시의 도움 (각각의 새로운 솔루션을 씻어)로 섹션을 전송합니다. 모든 배양 연속 교반 (최대 150 RPM)로 수행됩니다. <ol><li> 면역 조직 화학 (ABC 방법) <ol><li> 완전히 부동액을 제거하기 (10 분 각각 RT에서 5 회 4 ° C에서 한 번 O / N)를 TBS에 부동액에서 섹션을 이동 충분히 헹군다. </li><li> 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 종결 TBS-T에서 1.5 %의 H 2 O 2에서 30 분 동안 인큐베이션. 버블 링에주의하고 필요한 경우 섹션을-잠수함 다시. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 옵션 : 한편 가열 캐비닛과 37 ° C 2 N 염산을 예열. DNA를 변성 2 N 염산 37 ° C에서 30 분 동안 섹션을 품어. 브러시의 도움으로 조심스럽게 별도의 섹션. </li><li> 선택적 : 0.1 M 보레이트 완충액 pH에서 10 분간 부분 중화8.5, RT. 전송하는 동안, 잠시 염산 남은 것을 제거하기 위해 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입을 채취. 15 분마다 TBS에서 2 번 씻어. </li><li> 조직을 Permeabilize 하시려면하고 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 차단하는 TBSplus에 품어. </li><li> 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> TBSplus, 실온에서 3 시간 희석 바이오틴 이차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. 한편 ... </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (TBS-T에서 1 % + 1 % B)에 따라 ABC 단지를 준비합니다. 사용하기 전에 30 분 동안 실온에서 방치한다. 실온에서 1 시간 동안 AB 시약의 섹션을 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 각각 두 개의 반쪽 피펫 4 ml의 2 ml의 당 우물에 분할, 6 또는 12 웰 플레이트 당 TBS-T에서 50 ml의 0.5 ㎎ / ㎖ DAB를 준비합니다. DAB 용액 (주의로 전송 섹션! DAB 독성이다. 구체적으로 지정을 따라C 즉, 실험실 코트와 장갑을 착용 공급 업체에서 제공하는 MSDS는) 화학 흄 후드를 사용합니다. </li><li> 잘 과산화 반응을 시작하는 각 상기와 같이, 나머지 25 ml의 DAB 용액에 0.5 ml의 1 % H 2 O 2를 추가 혼합하여 피펫 동등한 볼륨. 12 분 동안 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 영구 장착 매체 커버 슬립. </li><li> 옵션 : 커버 슬립을 배치하기 전에 Counterstain과 (3.5 절 참조). 주 : 신호 - 대 - 잡음 비율이 높기 때문에 배경이 낮은 경우, AB 시약 (단계 3.1.8)와 인큐베이션 한 후 H 2 O 2 처리를 반복한다. </li></ol></li><li> 다중 면역 <ol><li> 단일 또는 동시에 여러 면역 형광 <ol><li> TBS에 부동액에서 섹션을 전송하고 철저하게 린스 (4 ° C에서 한 번 O / N을, 실온에서 10 분 동안 5 회)을 완전히 제거하기tifreeze. </li><li> 옵션 : 3.1.3 단계로 - 3.1.4. </li><li> 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 조직을 Permeabilize 하시려면 및 차단 TBSplus에 품어. </li><li> 차 항체 칵테일에 품어 (예를 들어, 쥐의 α-BrdU의, 기니 돼지-DCX α, 염소 α-GFP) 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> Fluorochrome과 접합 된 이차 항체의 칵테일에 품어 (예를 들면, 로다 민 레드 α-쥐, 알렉사-647 α-기니피그는 알렉사-488은 α-염소, 모든 당나귀에서 유래), TBSplus에 희석 3 시간 RT 또는 O / N에서 4 ° C에서. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 수성 매질과 마운팅 커버 슬립. </li></ol></li><li> 동일한 호스트 종에서 차 항체 순차 여러 면역 형광 <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1 단계로. </li><li> 인터넷에 품어첫 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 A), O / N 4 ° C에서. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 첫째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들면, 로다 민 레드 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 첫 번째 차 항체에 열린 paratopes을 포화 3 시간의 RT에 대한 기본 항체와 같은 호스트 (예를 들면, 토끼 혈청)에서 10 % 정상 혈청에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 50 μg의 (예, α - 토끼의 IgG (H + 1)가) 제 2의 2 차 항체, O / N에 의해 인식 될 수있는 에피토프를 덮도록 차 항체의 호스트에 대해 지시 / ㎖ 접합 일가 Fab 단편과 TBSplus 부화 4 ° C. </li><li> 10 분마다 TBS-T에 적어도 3 회 TBS에 한 번 씻어. 전송하는 동안, 짧게 SWAB 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입은 팹 남은 것를 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 두 번째 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 B), O / N에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 두 번째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들어, 알렉사-488 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립. 참고 : 다른 호스트 종을 추가로 항체와 항원의 레이블을하려면 3.2.2.2 단계와 각 이차 항체는 3.2.2.3 단계. </li></ol></li><li> 차 항체의 하나로서 같은 종의 차 항체의 하나 참고 :이 프로토콜은 GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX와 함께 BrdU의 또는 Ki67에 네 번 염색에 적합하다. <ol><li> 3.2.1.5 -에 따라 엄격하게 프로토콜은 3.2.1.1 단계를 반복합니다. 이 시점까지 TBSplus 만 당나귀 혈청을 사용합니다. </li><li> T에 품어RT에서 1 시간 동안 3 % 염소 혈청을 함유 BSplus. 이것은 α-염소 이차 항체에 열려 paratopes을 다룹니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> AMCA 비공에 품어. TBSplus, 3 시간의 RT 또는 O / N 4 ° C에 희석 염소 α-토끼. 15 분마다 TBS 세 번 헹구고 마운트 상기와 같이 커버 슬립. </li></ol></li><li> CldU, IDU 공동 염색 <ol><li> 린스 변성 및 3.2.1 절에 설명 된대로 섹션을 중화 (- 3.2.1.2 3.2.1.1 단계). </li><li> α-마우스 TBSplus에서의 IgG (H + L), RT에서 1 시간 20 ㎍ / ml의 접합 팹 조각으로 품어. 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 : 마우스 α-BrdU의 (350 1) : (IgG2을 정제 (400) 1) 쥐의 α-BrdU의를 포함하는 일차 항체 칵테일에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 바이오틴 당나귀 포함하는 이차 항체 칵테일에 품어 α를 쥐 (1: 500)과 FITC 비공. 당나귀 α-마우스 Fab 단편 (1 : 100). 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 로다 민 레드 비공에 품어. 스트렙 타비 딘, 실온에서 2 시간. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립. </li></ol></li><li> 네 스틴 - 생쥐에서 GFP 형광 신호의 증폭 <ol><li> 차 항체 칵테일에 염소 α-GFP를 추가합니다. </li><li> (. 이러한 알렉사 488 접속사로서 α-염소 당나귀) GFP와 유사한 분광 특성과 형광 색소 결합 된 이차 항체를 추가 이차 항체 칵테일에. </li></ol></li></ol></li><li> 에피토프 검색 <ol><li> 부동액을 세척 한 후 에피토프 검색을 수행하십시오. 99 ° C (약 25 분) - 0.1 M 시트 레이트 완충액 pH 6.0 ~ 95를 포함하는 6 또는 12 웰 플레이트 예열 증기선. </li><li> (30 분 동안 뜨거운 구연산 버퍼와 증기로 섹션을 전송 플라스틱 리터 알루미늄 호일 접시를 커버ID는 내열되지 않음). </li><li> 즉시 식혀 빙욕 플레이트를 배치했다. 이 출생 후의 동물의 뇌 부분 작업을 할 때 특히 중요하다 조직 형태를 보호하는 데 도움이됩니다. </li><li> 씻어과 구연산을 중화 및 염색을 계속 10 분 각각 TBS에서 3 번 씻어. </li></ol></li><li> 마우스는 마우스 조직에 항체가 <ol><li> -α 마우스 IgG 20 ㎍ / ml의 일가 Fab 단편 추가 (H + L을, 이차 항체에 비해 동일한 호스트 종)를 첫 번째 차단 단계 (예를 들어, 단계 3.1.5 또는 3.2.1.3). </li><li> 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어, 각각의 프로토콜로 진행합니다. </li></ol></li><li> 크레 실 바이올렛 대조 염색 <ol><li> (유리 항아리에) 60 ° C로 예열 크레 실 바이올렛 솔루션입니다. 3 분 동안 뜨거운 용액에 슬라이드를 품어. </li><li> 수성에 씻어. 이명. 및 70 %에 각각 1 분, 96 % 및 100 % 이소프로판올 2 회 탈수. </lI&gt; <li> 6 크실렌 분 또는 호환 영구 설치 매체와 크실렌 대체 및 커버 슬립 - 5 지우기. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 치아 이랑의 전체 rostrocaudal 정도에 따라 매 6 번째 섹션에서 퍼 옥시 다제 스테인드 신생아 세포를 계산합니다. 400 배 배율의 광학 현미경을 사용합니다. </li><li> 신생아 세포의 총 수의 추정치를 얻기 위해 교차 간격으로 얻어진 세포 수를 곱한다. </li><li> 형광 이미지는 적절한 레이저 시스템 및 필터를 구비 한 공 초점 레이저 현미경으로 라벨링 섹션. 400 배 배율의 치아 이랑의 전체 범위를 따라 임의의 위치에 이미지 스택을 가지고 다른 마커와 공동 라벨링 반구의 지분의 50 무작위로 선택된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 절대 계산하는 신생아 세포의 총 수와 공동 표지 된 세포 (/ 100 %)의 비율을 곱하여 얻어진특정 신생아 세포 집단의 숫자. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

정량화와 신생아 세포의 개체군의 식별은 성인 신경 연구의 중심 문제입니다. 성인 신경의 특정 단계에서 발현 된 단백질에 대한 증식 마커 및 항체를 결합하는 것은 이러한 개체군의 면역 검출 할 수있다. 항체 또는 항체 조합 중 일부는 특정 염색 조건을 필요로한다. 합성 티미 딘 유사체로 세포를 분할의 레이블은 아직 성인 해마의 신경 발생 연구를위한 황금 표준입니다....

두 뇌 영역 구조적으로 생활 전반에 걸쳐 새로운 신경 세포를 생성, 측뇌실의 뇌실 영역과 해마 치아 이랑 (DG)의 subgranular 영역 (SGZ). 신생아 신경 세포는 신경 전구 세포에서 파생 만기 1, 2에 도달하기 전에 형태 학적 및 생리 학적 개발의 여러 단계를 통해 이동합니다. 천천히 나누어 방사형 아교 세포와 같은 줄기 세포 (유형 1)에서 대중 교통의 연속적인 단계는 중간 전구 세포가 발생 증폭. 더 미분화 하위 유형 (유형 2A와 2B 형)는 짧은 접선 프로세스와 불규칙한 형상을 갖는다. 그들은 (수상 돌기는 분자 층으로 확장 포함) 점차적으로 미성숙 신경 세포가되기 위해 세포주기를 종료하고 마지막으로 해마 네트워크 성숙 과립 세포로 통합 neuroblasts (유형 3)을 생성합니다. 특정으로 인해 생리적 특성이 향상된 세포 가소성 삼 sugges으로 회로를 제공한다팅 해마의 기능에 고유 한 역할. 사실, 지난 십 년간의 연구는 성인 신경이 공간 기억, 패턴 분리 및 정서적 행동 4,5에 기여한다는 상당한 증거를 생성합니다. 성인 신경은 서로 다른 접근 방법을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 티미 딘 유사체는 세포주기의 S-단계에서 DNA에 통합하는 신생아 세포 6-8의 출생 연대, 정량 운명 분석을 할 수 있습니다. 다른 티미 딘 유사체 (예 CldU, EDU 또는 IDU)을 순차적으로 적용은 세포 또는 전도 (9)의 실험 과정 동안 상이한 시점에서 태어난 세포 집단을 연구하는데 사용될 수있다. 대안으로서, 세포 증식에​​ 대한 내인성 마커 Ki67이다. 이것은 세포주기 (G1, S, G2, M) 상을 제외한 휴지 (G0) 및 10,11 G1의 선두의 단계에서 모든 셀 분할 표현된다. 성인 dentat 신생아 세포 집단의 표현형을 분석하려면전자 이랑 여러 단계 특정 분자 마커는 GFAP, 네 스틴, DCX와 NeuN 1,6로 사용할 수 있습니다. GFAP 성숙한 아스트로 마커뿐만 아니라 성인 전뇌 래디얼 신경교 유사 세포에서 발현된다. 네 스틴은 반경 신경교 유사 세포와 초기 중간 전구 세포에 특이적인 중간 섬유이다. DCX 중간 전구 세포, 미성숙 neuroblasts 뉴런에서 발현 미세 소관 - 연관된 단백질이다. +, 네 스틴 - 입력 2A (GFAP - 1 형 (GFAP +, 네 스틴 +, DCX) :이 세 가지 마커와 네 가지 전구 세포 아형 식별 할 수있는 표지 세포의 형태 학적 특징 (공동) 식을 바탕으로 , DCX -), 2B 형 (GFAP - 네 스틴 +, DCX +) 및 3 형 (GFAP - 네 스틴 - DCX +) 1. 함께 postmitotic 신경 세포로 표현된다 NeuN, DCX와의 공동 라벨링 immatur의 분화를 할 수 있습니다전자 (DCX +, NeuN +)과 성숙 ​​(DCX - NeuN +) 과립 뉴런. 상술 한 마커가 자주 신생 세포의 수 및 정체를 분석 면역 공동 라벨 및 후속 공 초점 현미경에 사용된다. 이는 일반적으로 바람직하지 않은 항체 교차 반응을 방지하기 위해 다른 호스트 종으로부터의 항체를 필요로한다. 그러나, 신경 연구에 적합한 차 항체의 대부분은 중 토끼 나 쥐에서 (예를 들어, 마우스 α-BrdU의 마우스 α-NeuN, 토끼 α-Ki67, 토끼 α-GFAP)을 발생합니다. 이것은 단일 슬라이스로 평가 될 수있는 항원의 수와 조합하여 심각한 한계에 이르게. 이것은 차례로 다수의 염색이 수행 될뿐만 아니라 가지고, 염색 노력을 증가뿐만 아니라, 결과의 신뢰성을 손상시킬 수도있다. 또한, 일부 포르말린 고정 항원 유발 에피토프를 마스킹 (예 Ki67에 취약, 네 스틴). 우리는 여기에 클래식 단일 및 다중 immunolabeling 프로토콜에서 수정을 설명 (예를 들어, 에피토프 검색, 여러 순차적 면역 염색, 네 스틴-GFP 형질 전환 마우스 (12)의 사용)이 많은 문제를 극복. 특히, 다중 순차 면역 프로토콜은 항체의 일부가 동일한 호스트로부터 유도 되더라도 최대 네 개의 상이한 항원에 대해 염색한다. 이 동시 유형 1, 유형 2A, 2B 형 및 3 형 전구 세포의 검출뿐만 아니라 단일 섹션 내에서 증식 활동을 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

성인 신경 새로운 뉴런 점점 커미트 중간 선조 아형을 통해 활성화 된 신경 줄기 세포에서 생성되는 고도로 조절되는 다단계 공정이다. 이들 아형 각각은, 함께, 특정 형태 학적 기준 그들의 식별을 위해 이용 될 수있는 특정 분자 표지의 집합을 표현한다. 일반적으로, 면역 형광 기법은 엑소 또는 내생 증식 마커와 함께 하위 특정 항체를 포함하는 적용됩니다. 우리는 여기에 성인 해마 신경 세포의 모든 단계의 검출과 정량 방법을 immunolabeling에 대해 설명합니다. 이들은 티미 딘 유사체, transcardial 관류, 조직 처리, 열 - 유도 에피토프 검색, 면역 조직 화학 ABC 여러 간접 면역 형광 공 초점 현미경 및 셀 정량의 적용을 포함한다. 또한 우리는 문제 U를 피하는 순차적 여러 면역 형광 프로토콜을 제시sually 같은 숙주 종에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 필요성으로부터 발생. 그것은 하나의 섹션 내에서 증식 마커와 함께 모든 해마 전구 부속 유형의 정확한 식별을 할 수 있습니다. 이러한 기술은 병렬로 다른 전구 서브 타입의 조절, 뇌 병변에서의 참여와 특정 뇌 기능에서의 역할을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.

우리는 정량화 및 출생 후 성인 해마에서 신생아 세포의 특성을 위에서 설명한 방법을 적용했다. 따라서, 우리는 야생형 및 신경 결핍 사이클린 D2는 신경의 비율 (즉, 농축 환경, EE) 13, 14에 영향을 미치는 것으로 알려진 조건에서 보관 (Ccnd2 KO) 마우스를 내라 사용. Ki67, BrdU의, CldU 또는 이두 중 하나에 대한 면역 조직 화학 DAB 염색은 지속적으로 야생형과 Ccnd2 KO 마우스 <...

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Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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비디오: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

연구

신경과학

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.