1. 숙주 세포에 transfection <ol><li> 종자 2 X 10 15 ML 성장 매체 (세포핵과 nucleosides와 MEMa (Gibco, 카탈로그 번호 12571) 10 % γ - 반구 특징 태아 소 혈청 (cFBS) (HyClone와 보충 T75 코닝 세포 배양 플라스크 6 CHO - DXB11 전지 카탈로그 번호 SH30071.03) 10 ML / 45 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)) transfection 전에 하루 L. </li><li> transfection 당시, 다음과 같이 transfection의 단지를 준비 : <ol class="lalpha"><li> 멸균 microcentrifuge 관에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 8 μg DNA를 희석. 부드럽게 섞는다. </li><li> 폴리스티렌 튜브에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 40 μl Lipofectamine ™ (Invitrogen 18,324,012)을 희석. </li><li> 희석 Lipofectamine ™의로 희석 DNA를 추가합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 30 분 알을 품다. </li></ol></li><li> T75에서 세포의 성장 매체를 제거하고 혈청없이 성장 매체의 6.4 ML로 바꿉니다. 술병에 transfection의 단지의 1.6 ML를 추가합니다. 플레이트 락을하여 부드럽게 섞는다. </li><li> 6 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C 세포를 품어. </li><li> 37 술병과 부화 ° 하룻밤 CO 2 배양기에서 C로 성장 매체의 8 ML을 추가합니다. </li><li> 열망으로 매체를 제거하고 플라스크에 신선한 성장 매체를 추가합니다. 하룻밤 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. </li><li> (MEMa 매체 세포핵 또는 nucleosides없이 (Gibco, 카탈로그 번호 12561) 10 % γ - 반구 dialyzed 태아 소 혈청 (dFBS) (HyClone, 카탈로그 번호 SH30079.03) 10 ML / L 45과 보충 선택 매체와 성장 매체를 교체 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)). </li><li> 2-3주에 대한 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. </li></ol> 2. 유동세포계측법 활성 셀 정렬에 의해 복제 <ol><li> 4 5 분 동안 800 rpm으로 술병과 원심에서 세포를 이동시키다 ° C. </li><li> 1시 20분 희석에 2% 소 혈청 알부민과 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체와 보충 선택 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 15-30분 위해 얼음에 부화 후 차가운 PBS로 두 번 씻는다. 폴리 프로필렌 튜브에 1X PBS로 세포를 Resuspend. </li><li> BD FACSAria ™에서 무균 정렬 준비. 각 물론 200 μl 선택 매체를 포함 96 - 웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 세포와 튜브를로드하고 BD FACSAria ™에 대한 분석, 각각 스테인드와 흠없는 세포에 대한 결과를 기록합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 (S)에 원하는 형광 염색법 프로필의 단일 세포를 정렬하기 위해 성문과 설정을 설정합니다. <ol class="lalpha"><li> Transfected 세포가 처음 기대 산란 대 측면 뿌리를 기반으로 분석됩니다. 라이브 세포 게이트는 세포의 복잡하거나 세분을 측정 셀의 크기, 측면 산란을 측정 앞으로 산란을 기반으로 이루어집니다. </li><li> 이 게이트 내의 가을 세포는 다음 체육 얼룩에 대해 검사됩니다. PE 부정 게이트는 흠없는 transfected 세포 또는 스테인드 호스트 세포에 대해 설정됩니다. 스테인드 transfected 세포는 FACS에 의한 검사이므로 &quot;높은 PE&quot;게이트는 다음 체육 얼룩에 대한 긍정적인 모든 세포의 상위 5 %를 포괄하는 delineated있다. </li></ol></li><li> 두 주 동안 37 ° C 배양기에서 번호판을 품어. </li></ol> 3. CloneSelect ™ 영상기에 의해 식민지 형성의 문서 일 0, 3 일, 정렬 후 FACS 일 7 일 13 CloneSelect 영상기 ™에서 96 - 웰 플레이트 문서의 식민지 형성. 이미지 문서는 단일 세포에서 유래 클론의 선택을 보장합니다. 그 시점에서 각 우물에 하나의 세포가 있기 때문에이 문서에서 중요한 단계는, 당일 공 측정 올바르게 조정 초점 비행기를 받고있다. 그것은 그 하나의 세포의 이미지가 초점에 그들의 초점을 조정하려고 시도하는 것이 최상의 오해를 할 수있는 것이 매우 중요합니다. 초점 비행기는 접시의 브랜드간에 크게 다를 수 있으며 어쩌면 많은에서 같은 브랜드의 많은 수도 있습니다. 따라서 미리 정해진 초점 비행기 사용해야합니다. 이것은 테스트 마이크로 비즈 또는 사용되는 동일한 많은의 접시에 입금 고밀도 세포에 초점을하여 수행할 수 있습니다. 또는 같은 많은에서 자란 플레이트는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. FACS는 정렬 후, 그들은 접시에 위치에 &#39;고정&#39;될 수 있도록, 세포가 이전 이미지 2 시간의 최소 정착하게하는 것도 중요하다. 4. 심사 및 높은 생산성 클론 선정 <ol><li> 수신 96 - 웰 플레이트 분석 문서의 샘플 위치. </li><li> TECAN 자유 에보 (Evo)에 의해 96 - 웰 플레이트 분석에 20 μl 뜨는 (필요시 희석) ® 액체 처리 시스템의 전송 aliquots. 이것은 유연하고 가능한 로봇IC 플랫폼이 다른 자동 세포 배양 작업에 맞게되었습니다. 특별 프로그램은 최상의 활용 및 세포주 개발을위한 자유 에보 (Evo) 로봇 기능을 향상시키기 위해 작성되었습니다. 이 예제는 하나의 식민지로 우물을 샘플링에 대한 CloneSelect ™ 영상기 데이터를 해석하는 TECAN 설정입니다. 다른 프로그램이 필요한 경우 높은 생산 클론을 확장하기 위해 적절한 해석하는 찍은 샘플 dilutions, 카탈로그 및 샘플 수동으로 표시된 접시를 만들기 위해 같은 추가적인 세포 배양 작업을 수행하는 데 필요한 있었다 이러한 프로그램 등 대부분 쉽게 수 384 잘 접시뿐만 아니라, 원래 96 자 형식으로 적용. </li><li> 샘플의 항체 생산은 TECAN 자유 에보 (Evo)에서 엘리사를 (피어스, 록퍼드, IL) 검출 샌드위치 인간 IgG ® 액체 처리 시스템에 의해 분석됩니다. <ol><li> 샘플 및 표준 (인간 골수종 IgG1, 카파가) (시그마, 세인트 루이스, MO) 사전에 바이오 코팅 코트 안티 인간 IgG 분석 플레이트 (BD Biosciences, 산호세, CA)에로드되었습니다. </li><li> 접시 세 PBS에 세척 다음 두 시간 동안 실온에서 incubated했다. </li><li> ImmunoPure의 염소 안티 - 인간 IgG (FC - 감마) - HRP는 (피어스, 록퍼드, IL) 1:2000 희석에서 판에 추가 및 실내 온도에 한 시간 동안 incubated되었습니다. </li><li> 접시는 ABTS 기판을 (피어스, 록퍼드, IL) 추가하기 전에 PBS로 세 번 씻어되었으며 검출을위한 405 nm의 흡광도에서를 사용하여 접시 리더에서 읽을 수 있었다. </li></ol></li><li> 높은 생산성 클론을 선택하고 서스펜션 문화 생산성을 평가합니다. 먹이 - 배치 문화, 전지가 65578이 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 5 G / L 간장 hydrolyzate (DMV 국제 카탈로그 번호 SE50MAF - University of Florida의, 많은 보충 단백질 무료로 중간 JRH 즉각적인 기회만에 0.3X106 세포 / ML에 주사를했다 수)와 37 incubated ° C 7.5 % CO 2. 문화 계속해서 2g / L의 포도당 (시그마, 카탈로그 번호 G8769, 많은 번호 098K2329) 문화에 포도당 플러스 젖산 농도가 2g / L 이하에 도달하고, 싫증이 MM 글루타민 (Gibco, 카탈로그 번호 25030와 보충했다 글루타민 수준 200 이하에 도달 많은 번호 568177) MG / L (어떡하지 Bioanalyzer로 측정 metabolites). 연방 - 일괄 문화가 14 일 항체 생산에 대한 해고하는 것은 반대 위상 HPLC로 측정되었다. </li><li> 원위치 하이브리드화 (물고기) 5 형광에 의해 후보 클론의 유전 특성. </li></ol> 5. 대표 결과 : 높은 처리량 방법과 클론 항체를 생산 개발의 예제는 그림 1과 그림 2에 표시됩니다. Transfected 세포 수영장은 찬란 레이블 안티 인간 IgG 항체 (그림 1A)와 스테인드 분석 BD FACSAria ™ (그림 1B)에 정렬되었습니다. 96 - 웰 플레이트에 콜로니 형성이 CloneSelect 영상기 ™ (그림 1C)에 몇 군데되었습니다. 세포 배양 뜨는은 단일 군락을 포함 우물에서 샘플과 TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템 (그림 1D)에 엘리사에 의해 assayed했다. 높은 생산성 클론은 형광 레이블 안티 인간 IgG와 얼룩으로 반영 높은 표면 항체 수준을 전시 세포에서 발견되었습니다. 초기 transfected 세포 수영장의 두 인구, 문화 (그림 2) 관찰되었습니다 먹이 - 배치의 생산성에 막대한 차이에서 발생하는 클론을 비교하면. 높은 표면 항체 표현 (PE 높은)와 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론 들어, 특정 생산성 50-70에서 원거리 PG / 휴대폰 / 일. 항체 생산성했습니다 반면 ~ 20 PG / 낮은 표면 항체 표현 (PE 낮은)로 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론에 대한 셀 / 일. 또한, FACS 정렬 개발한 셀 라인 수동 liming 희석 (그림 3A)를 통해 복제된 것을 그 이상의 항체 생산과 관련하여보다 안정하고 있습니다. 상단 복제의 구체적인 생산성, 수동 liming 희석에 의해 생성된 &quot;복제 1&quot;~ 30에서 80 세포 doublings에 대한 culturing 후 PCD ~ 10 PCD 하락했다. 반면에, &quot;복제 2&quot;정렬 FACS에 의해 생성되는 상단 subclone은 최소 100 세포 doublings 20 PCD 주변 구체적인 생산성을 유지할 수있었습니다. 원위치 하이브리드화 (물고기)에 형광등에 의해, 우리는 코로 1 표현형의 혼합 인구로 나타났다 (85 ​​%)과 표현형 B (15 %).을 증명 대조적으로, FACS는 (복제 인간 2) 클론을 정렬하는 것은 세포의 99.5 %로,보다 균일한 인구로 보여주 표현형 것으로 판명 (그림 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. CHO 세포에서 단클론 항체의 생산을위한 제조 셀 라인의 개발. 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체로 초기 transfected 세포 수영장) 표면 얼룩. B) 96 - 웰 플레이트에 높은 형광 강도 (PE 높은)와 낮은 형광 강도 (PE 낮은)과 세포 인구의 정렬. C) 식민지를 문서화CloneSelect 영상기 ™에 날로부터 형성이 0 일 13 게시물 시딩. 엘리사에 의해 D) 상영 클론. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 표면 관련된 항체 수준은 세포의 항체 생산과 연결합니다. 높은 낮은 형광 염색법과 클론은 셀 라인으로 개발 및 공급 - 배치 문화에 평가했다 둘 다. 용적 titer하고 구체적인 생산성은 각 인구의 상위 2 클론 사이에 비교했다. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 높은 유전 균질성 및 복제 안정성을 전시 정렬 FACS에서 생성된 클론. 문화 경과 시간 ~ 80 셀 doublings에 대한 배치 문화에 A) 항체 생산 안정성. Δ는 복제는 세포 / 세포에서 잘 2,000 1,000 세포 / 음 500 세포 / 잘 씨앗을 품고 있었다 제한 희석을 통해 생성되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="검정색 삼각형" /> , 클론는 1 셀 / 마저 FACS를 통해 생성되었습니다. B) CHO 세포 염색체에 Transgene 통합 사이트는 현장 하이브리드화에 형광등에 의해 식별됩니다.

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	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

이 문서의 저자는 포유 동물 세포 라인에서 단백질 치료제의 대규모 생산이 방법을 사용 머크 &amp; 유한 주식 회사의 직원입니다.

우리는 clonality와 클론의 안정성을 보장하면서 높은 생산성 클론의 고립을 가능하게하고, 의미의 자동화된 생산 세포주 개발 플랫폼을 발표. FACSAria ™ 셀 정렬 뒤에 표면 항체 얼룩의 참여가 높은 항체 생산성과 단일 클론을 취득하는 열쇠입니다. 우리의 결과 및 기타 보고서 2-4 transiently 세포 표면에 표시되는 항체 수준이 세포의 생산성과 잘 상관 것이 좋습니다. 따라서, 플루오레신 - 복합 항체는 멤브레인 관련 제품을 인식하고 높은 생산자의 절연을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 기자의 유전자와 겔 microdrop 기술의 coexpression은 FACS 6-8으로 높은 생산 클론의 선택을 촉진하는 데 사용되었습니다. FACS를 통해 높은 생산 클론을 분리하는 것 외에도 다른 기술은 동일한 목표를 달성하기 위해 진화합니다. 이들은 높은 생산성 클론을 파악하고 원치 않는 세포, 형광 항체 탐지 시스템을 사용하여 생산 세포 라인의 높은 처리량 검사를 수행 Genetix ClonePix FL 및 StemCell 기술 ClonaCell EasyPick 플랫폼을 제거 microspere 항체 검출 시스템 및 레이저 심사 기술을 사용하여 격자 Bioscience CellSpot 기술을 포함 . 우리는 작업의 용이성, 생산성 및 clonality에 대한 선택도를 결합하기 때문에 표면 관련된 항체 수준에 따라 FACS 복제 방법을 구현하기로 결정했습니다. TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템의 고용은 크게 훨씬 더 큰 셀 수영장에서 높은 항복 클론에 대한 선택 기회를 제공 심사 처리량을 증가했다. 이러한 HTRF, BioForte 진수, HPLC 등 같은 분석을위한 다른 장비가 높은 제작자를 선택하고 낮은 생산을 심사의 가능한 모든 수단입니다. CloneSelect 영상기 ™와 클론 형성을 추적함으로써, 우리는 디지털 셀 라인 역사를 자랑하는 clonality을 증명하는 데 필요한 문서를 생성. Clonality는 더욱 유전자 염색체에 하나의 transgene 통합 사이트를 특징으로 확인됩니다. 보통 clonality을 보장하기 위해 가져옵니다 subcloning 단계는, 따라서 제거 수 있습니다. 이것은 세포주 개발을위한 시간 4~8주을 저장합니다. 요약에서, 높은 처리량 자동화 플랫폼에 의해 생성된 품질 셀 라인은 높은 생산성, 생산 안정성과 대규모 생산과 현재의 규제 요건에 대한 수요를 충족해야합니다 문서화 세포주 기록을 보여주었다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> BD FACS 아리아 ™ 세포 분류기 </td><td> Bioscience BD </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ 영상기 </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템 </td><td> Tecan 그룹 </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

급성장 biopharmaceutical 산업은 마약 공급에 대한 증가하는 요구 사항을 충족하기 위해 매우 효율적이고 안정적​​인 생산 시스템의 신속한 개발을 요구하고 있습니다. 생산 세포 라인의 생성은 전통적으로 노동 집약, 낮은 처리량 및 인적 오류에 취약 수동 작업을 참여하고 있습니다. 우리는 여기서 단백질 치료제의 생산을위한 제조 셀 라인의 개발을위한 통합된 높은 처리량 및 자동화 플랫폼을보고. BD FACS 아리아의 결합 ™ 세포 분류기, CloneSelect ™ 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo)는 ® 액체 처리 시스템은 높은 처리량 및보다 효율적인 세포 라인 개발 프로세스를 사용할 수 있습니다. 이 작업에서는, 생산 호스트 세포가 먼저 선택 요원과 함께 치료에 이어 관심 1의 유전자를 운반 발현 벡터와 함께 transfected 있습니다. 안정 - transfected 세포는 다음 형광 라벨이 표시된 안티 인간 IgG 항체 물들일 및 유동세포계측법 분석 2-4로 이후 대상입니다. 높은 생산 세포는 형광 강도에 따라 선택되고 BD FACSAria ™에 대한 단일 셀 정렬에 의해 격리됩니다. 단일 셀 단계에서 콜로니 형성이 미세하게 감지되었으며 시간 바퀴 디지털 이미지의 일련 세포주 역사의 설명서 CloneSelect ™ 영상기으로 촬영하고 있습니다. 단일 클론이 형성되면,이 클론은 TECAN 자유 에보 (Evo)에서 수행 엘리사에 의해 생산성 ® 액체 처리 시스템에 상영되었습니다. 약 2,000 - 10,000 클론은 현재 시스템 설정과 함께 작동주기에 따라 검사를하실 수 있습니다. 이 통합 방식은 치료 단클론 항체 (mAb)뿐만 아니라 융합 단백질의 생산에 대한 높은 생산 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 라인을 생성하는 데 사용되었습니다. 검출 프로브의 종류의 도움으로, 방법은 다른 단백질 치료제를 개발하고 사용할 수있는 다른 생산 호스트 시스템에 적용됩니다. 전통적인 수동 절차 비교, 이런 자동화된 플랫폼은 크게 증가 용량, 보장 clonality, 전자 문서로 셀 라인의 역사에 추적성 및 연산자 오류 훨씬 감소 기회의 장점을 보여주었다.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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Research

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22.2K 조회수.  Merck & Co., Inc. 단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

연구

의학

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

작은 쥐의 Cystometry의 사용 : 방광 Chemosensation의 연구

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

깨어 마우스로 CNS의 치료학의 비강 관리

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

기본 종양 및 / 또는 전임상에 대한 관련 전이 및 치료제의 임상 개발의 전 생체 치료 응답

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...