Hello.Today 우리는 수백만 개의 옥수수 중엽 세포를 원형질화하고 고효율로 변형시키는 프로토콜을 보여줄 것입니다. 프로토콜의 주요 단계는 먼저 식물 세포벽을 소화 및 제거하고 원형질체를 방출한 다음 PEG를 사용하여 원형질체를 형질전환시키는 것입니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 가장 큰 차이점은 변환의 규모입니다.
대부분의 프로토콜은 1, 000에서 10, 000 사이의 형질전환된 원형질체로 끝납니다. 그러나 우리의 프로토콜은 수백만 개의 변형 된 옥수수 원형질체를 제공합니다. 여기에 발아 후 9-11 일 동안 어둠 속에서 자란 옥수수 묘목이 있습니다.
묘목을 토양 수준 바로 위에 자르고 물에 넣으십시오. 사용하지 않을 때는 식물을 어둠 속에 보관하십시오. 각 묘목의 두 번째 및 세 번째 잎을 선택하고 갈색 또는 손상된 부분이있는 잎을 제외하도록주의하십시오.
12-16 개의 잎을 선택하고 끝에서 센티미터를 잘라냅니다. 그런 다음 각 잎에서 10 센티미터 부분을 자릅니다. 기초 끝을 함께 사용하여 잎 부분을 서로 겹쳐 쌓습니다.
Clamp 바인더 클립을 사용하여 베이스 끝에서 번들을 함께 고정합니다. 흰 종이 위에 나뭇잎 묶음을 놓습니다. 너비가 0.5-1 밀리미터 인 잎 조각을 자릅니다.
얇고 일관된 슬라이스를 자르는 것이 중요합니다. 잎 다발의 일부를 자른 후 슬라이스를 효소 용액으로 옮깁니다. 재료가 마르지 않도록 하십시오.
효소 용액을 부드럽게 소용돌이 치면서 재료를 적십니다. 빛을 차단하기 위해 비커 위에 호일을 놓습니다. 전체 번들이 바인더 클립 가까이에서 절단될 때까지 이 과정을 반복합니다.
절단 후 솔루션은 다음과 같아야합니다. 효소 용액 비커를 벨 항아리에 옮깁니다. 실온에서 3 분 동안 진공 침투합니다.
실온에서 40RPM의 탁상용 셰이커에서 2시간 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 용액을 소용돌이 치십시오. 유백색으로 보이며 성공적인 소화를 나타냅니다.
실온에서 80RPM으로 탁상용 셰이커에서 10분 더 배양합니다. 효소 용액이 담긴 비커를 얼음 위에 놓습니다. 얼음처럼 차가운 MMG 1 부피를 첨가하여 소화를 중지하십시오.
40 미크론 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 여과합니다. 용액을 각각 10 밀리리터 이하의 부분 표본으로 나눕니다. 차가운 둥근 바닥 유리관에 붓습니다.
튜브를 100G에서 4분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 제거하십시오. 다시 일시 중단한 다음 후속 세척을 위해 샘플을 풀링합니다.
5 밀리리터의 MMG로 원형질체를 두 번 씻으십시오. 매번 100G에서 3분 동안 회전합니다. 펠렛은 아름답고 밝은 노란색 녹색이어야합니다.
튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 펠릿을 다시 매달아 놓을 수 있습니다. MMG 1 밀리리터에 재현 탁하고 계산을 위해 작은 부분 표본 10-20 배를 희석하십시오. 원형질체가 빨리 가라앉기 때문에 알리쿠팅 전에 잘 재현하는 것이 중요합니다.
희석된 원형질체를 혈구계에 넣습니다. 광학 현미경으로 원형질체를 계산합니다. 좋은 준비는 세탁 후 떠다니는 과도한 파편이 많지 않습니다.
좋은 원형질체는 눈에 보이는 색소체가 있는 원형입니다. 셀 개수를 사용하여 총 수를 계산합니다. 이 준비는 1,000만 개가 조금 넘는 원형질체를 생성했습니다.
플루오레세인 디아세테이트 염료를 사용하여 생존력을 확인하는 것이 좋습니다. 성공적인 원형질체 분리는 70%에서 90% 사이의 생존율을 산출합니다원형질체를 관심 있는 플라스미드와 혼합하십시오. 이 예에서는 100만 개의 원형질체와 15마이크로그램의 DNA를 사용합니다.
얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 튜브의 측면을 두드려 다시 매달아 놓습니다. 12%PEG의 최종 농도에 도달하기 위해 PEG 용액을 추가합니다.
여러 번 뒤집어서 부드럽게 섞습니다. 원형질체와 PEG 용액은 깨지기 쉽기 때문에 튜브를 흔들지 마십시오. 실온의 어두운 곳에서 10 분 동안 배양하십시오.
5 부피의 배양 용액으로 희석하고 반전으로 부드럽게 혼합하십시오. 튜브를 100G에서 4분 동안 원심분리합니다. 1 밀리리터 배양액으로 한 번 씻으십시오.
펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 100G에서 3분간 회전시킵니다. 배양 완충액에서 마이크로리터당 500 내지 1000 세포의 농도로 재현탁한다.
실온에서 밤새 어둠 속에서 배양하십시오. 다음날 100G에서 4분 동안 회전합니다. 식힌 배양 용액으로 두 번 씻으십시오.
실온에서 100G에서 3분 동안 매번 회전시킵니다. 다시 일시 중단한 다음 최종 확인을 위해 혈구계에 작은 분취량을 로드합니다. 먼저, 명시야 하에서 원형질체의 총 수를 세십시오.
이제 자외선 하에서 형광을 발하는 원형질체의 비율을 관찰하여 형질감염을 확인합니다. 원형질체는 GFP 리포터를 표현하고 있습니다. 이제 transfection 효율성에 대한 몇 가지 메트릭을 살펴보겠습니다.
이 준비에서 우리는 총 1,000만 개의 원형질체를 얻었고 그 중 100만 개를 형질감염시켰습니다. 다음날, 우리는 335, 000을 회수했습니다. 그 중 우리는 30.3 %의 형질 전환율을 보였으며 GFP를 발현하는 총 100, 000 개의 원형질체가 남았습니다.
형질주입 효율은 다양할 수 있다. 차트에서 볼 수 있듯이 반복적 인 준비 중에서 20 %에서 50 % 사이의 효율성을 일상적으로 볼 수 있습니다. 이 프로토콜은 수백만 개의 옥수수 중엽 원형질체의 수집 및 형질전환을 허용합니다.
프로토콜의 가장 좋은 부분 중 하나는 확장 기능입니다. 형질전환에 사용되는 원형질체의 수뿐만 아니라 부피의 양을 조정함으로써 형질전환을 오늘 보여준 것보다 훨씬 더 증가시킬 수 있습니다. 현재까지 우리의 가장 큰 단일 튜브 실험은 2천만 개의 원형질체와 200마이크로그램의 DNA로 시작하여 다음날 310만 개의 형질전환된 원형질체로 끝났습니다.
이 고처리량 프로토콜은 다양한 플라스미드 구조를 테스트해야 할 때 특히 유용하지만 공동 연구자는 합성 유전자 회로 및 옥수수 설계와 같이 확장 기능이 필요하지 않은 목적으로 이 프로토콜을 사용했습니다. 저희 영상을 시청해 주셔서 감사합니다. 도움이 되었기를 바랍니다.
