이 신비는 엽록소에 단백질 입력과 같은 세포 생물학의 필드에 있는 몇몇 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 엽록소에 단백질 입력이 en vivo 조건하에서 연구될 수 있다는 것입니다. 이준호와 강향주가 수술절차를 시연할 예정이다.
우선, 2주 된 식물에서 1~2개의 B5 플레이트에서 잎 조직을 수확하십시오. 수술용 칼을 사용하여 잎을 수확하고 효소 용액 25밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 튜브를 회전 셰이커에 수평으로 놓고 어둠 속에서 섭씨 22도에서 부드러운 교양으로 배양하여 8~12시간 동안 만 만 잎이와 줄기만 용액에 남아 있습니다.
인큐베이션을 완료한 후, 140마이크로미터 모공 크기의 메쉬를 통해 방출된 프톱라스트를 함유한 효소 용액을 신선한 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 50 밀리리터 원추형 튜브에 21% 자당 용액의 15 밀리리터 위에 신중하게 솔루션을 레이어링합니다. 가장 낮은 가속 및 감속 설정으로 98 gs에서 스윙 버킷 로터에서 튜브를 원심 분리합니다.
그 후, 파투라 파이펫을 사용하여 효소 용액을 함유하는 최상위 층과 효소 용액과 자당 용액 사이의 인터페이스에서 프톱서스트를 조심스럽게 제거합니다. 이 솔루션을 W5 용액 30밀리리터를 포함하는 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 혼합하는 것을 반전시십시오. 6 분 동안 51 gs에서 튜브를 원심 분리합니다.
파이펫을 사용하여 펠릿의 프톱라스트를 방해하지 않고 이 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. W5 용액 25밀리리터를 추가하고 프토플라스트를 부드럽게 다시 중단합니다. 안정화를 위해 4°C 의 냉장고에 최소 1시간 동안 인큐베이션을 사용해 보임합니다.
섭씨 4도 의 배양 후, 2 분 동안 46 gs에서 그들을 원심분리하여 프토플라스트를 완전히 펠렛. 수퍼네텐트를 완전히 제거하고 프토플라스트 펠릿에 MANG 솔루션을 추가하여 밀리리터당 6회에서 10배까지 5회 달성합니다. 파이펫을 사용하여 플라즈마 DNA 10마이크로그램과 300마이크로리터의 프토플라스트 용액을 신선한 13밀리리터 라운드 바닥 튜브에 추가합니다.
튜브를 손으로 부드럽게 회전한 다음 즉시 새로 준비된 40% PEG 용액 300마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 거의 수평으로 기울이고 손으로 여러 번 부드럽게 회전하여 완전히 섞습니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.
그런 다음 W5 용액 1 밀리리터를 넣고 튜브를 손으로 부드럽게 회전시켜 완전히 섞습니다. 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 처음 1.5 밀리리터를 추가한 다음 W5의 밀리리터 2개를 추가하고 최종 첨가 및 혼합 후 30분 동안 배양하여 두 번 더 반복합니다.
46 gs에서 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다. 펠릿에 W5 용액 2밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어, 하지만 완전히 이전과 같은 방식으로 섞습니다. 어두운 챔버에서 섭씨 22도에서 18 시간 동안 배양하십시오.
플로레시언 현미경을 사용하여 단백질 수입을 분석하려면 트리밍 팁이 있는 파이펫을 사용하여 프로토프스트 용액 10마이크로리터를 유리 슬라이드에 배치합니다. 커버 슬립을 사용하여 프스토플라스트가 손상되지 않도록 솔루션을 조심스럽게 덮습니다. 녹색 형광 단백질과 엽록소 자동 형광을 관찰하기 위해 설정된 흥분 입학 필터와 형광 현미경의 단계에 슬라이드를 놓습니다.
냉각 충전 커플 장치 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 상상하는 편집 소프트웨어를 사용하여 의사 색상 이미지를 생성합니다. 총 단백질 추출 및 면역 블로팅의 경우, 프토플라스트 용액에서 1밀리리터를 제거하고 나머지 1밀리리터를 섞는다. 이 프토플라스트 용액을 원심분리기 튜브와 원심분리기46gs로 4분간 전송합니다.
원심분리를 완료한 후 상체를 제거하고 80마이크로리터의 디나처레이션 버퍼를 추가합니다. 소용돌이는 5초 동안 활발하게 합니다. XDS 샘플 버퍼 5개에 넣고 잘 섞고 10분간 끓여 자연을 제거합니다.
표준 STS 페이지와 항GFP 항체를 가진 면역 블로팅으로 진행하십시오. RbcS 및 TGFT는 GFP에 융합된 이동 펩티드를 함유하는 RBCS의 79말단 말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 융합 구조로, 플로레스션 현미경 검사법과 면역블로팅에 의해 엽록소로 단백질의 수입을 연구하는 데 사용되었다. 플로레시언 현미경검사법에 의해 검사될 때, 대상 단백질의 녹색 형광 신호는 엽록소 자동 동체로부터의 적색 형광 신호와 병합되어 단백질이 엽록소로 수입함을 나타냅니다.
총 단백질을 분리한 후 면역블롯에서 두 개의 단백질 밴드가 관찰되어 단백질이 엽록소로 적절히 수입되었다는 것을 보여줍니다. 상부 대역은 엽록소로 가져온 후 처리된 형태에 전체 길이 전구체 및 하부 대역에 해당한다. 단백질의 가공된 형태의 양은 시간에 따라 증가하여 단백질이 엽록소로 수입된다는 것을 시사합니다.
이 발달에서, 이 기술은 세포 생물학의 필드에 있는 연구원이 아라비도시스에 있는 단백질 피곤또는 막 스레드 따기를 탐구하는 도로를 포장했습니다.
