이 연구는 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (부여 # 13GW0043C)와 유럽 우주 항공 연구 개발국 (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)의 연구비 지원에 의해 지원되었으며,

1. RPE 세포 배양 <ol><li> 돼지 눈에서 RPE 세포 분리 <ol><li> 지역의 도축장에서 새롭게 적출 된 돼지 눈을 구하십시오. 차가운 곳 (4 ° C)과 어두운 곳에서 보관하십시오. </li><li> 가위로 세포 외 조직을 제거하고 눈을 소독액에 5 분간 담근다. </li><li> 사용하기 전 칼슘과 마그네슘이없는 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS (-))에 눈을 넣으십시오. </li><li> 메스를 사용하여 각막 윤부 후방 약 5 mm에서 공막을 관통시킵니다. 각막 윤부와 평행하게 모든 방법을 통해 가위로 절단하여 눈 앞부분 전체를 절제하십시오. </li><li> 눈 앞부분 ( 즉, 각막과 렌즈)과 유리체를 제거하십시오. PBS (-) 1 ML을 추가하고 부드럽게 신경 망막을 제거합니다. 참고 :이 &quot;안구 컵&quot;은 공막, 맥락막 및 RPE로 구성되어 이제 준비되었습니다. </li><li> P에서 예열 된 (37 ° C) 0.25 % 트립신 추가BS (-)를 아이 컵에 넣으십시오. 아이 컵의 약 80 %가이 트립신 용액으로 채워지도록 볼륨을 조절하십시오. </li><li> 37 ° C에서 10 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 트립신 용액으로 아이 컵을 배양하십시오. </li><li> 인큐베이터에서 아이 컵을 제거하고 0.05 % 트립신 + 0.2 % ethylenediaminetetraacetic 산 tetrasodium 소금 (EDTA · 4N)와 PBS (-) 솔루션과 0.25 % 트립신 솔루션을 대체하십시오. 45 분 동안 인큐베이터에서 아이 컵을 품어 라. 참고 : 45 분 후 RPE 세포는 Bruch의 막에 느슨하게 부착되거나 이미 분리되어 트립신 -EDTA 용액에 부유합니다. </li><li> 부드러운 pipetting하여 RPE 세포를 수집합니다. 10 % 돼지 혈청, 항생제 / antimycotic 및 나트륨 pyruvate (1 MM)를 포함하여 문화 매체 (L - 글루타민과 DMEM 높은 포도당), 10 ML으로 가득 원뿔 튜브에있는 세포와 솔루션을 수집합니다. 참고 : 혈청은 트립신의 효과를 중화시킬 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기실온에서 5 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액. </li><li> 뜨는을 제거하고 신선한 매체 10 ML을 추가합니다. 같은 조건에서 5 분 동안 다시 원심 분리하십시오. </li><li> 세포 농도가 5 x 10 5 세포 / ML (hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하여 결정) 결과에 따라 뜨는을 제거하고 새로운 매체를 추가합니다. 부드러운 pipetting하여 잘 섞는다. </li><li> 세포 현탁액을 세포 배양 접시에 분배하십시오. 직경 60mm의 배양 접시 당 3ml를 사용하십시오. 참고 :이 배양을 통로 영 (P0)이라고합니다. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 세포를 유지하십시오. 매 2 일마다 조정 된 배지의 반을 새로운 배지로 변경하십시오. </li><li> 합류하는 경우 이관 (1.2 단계). </li></ol></li><li> RPE 세포 배양의 계대 <ol><li> 배양액을 제거하고 PBS (-)로 세포를 두 번 헹구십시오. </li><li> 0.05 % 트립신 + 0.2 % EDTA와 PBS (-) 솔루션으로 세포를 품어5 % CO 2 배양기에서 37 ℃로 5 분간 배양 하였다. </li><li> 부드러운 pipetting하여 RPE 세포를 분리하고 10 % 돼지 혈청을 포함한 10 ML의 매체로 가득 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집하십시오. </li><li> 상온에서 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 뜨는를 제거하고 세포 농도 5 X 10 5 세포 / ML (hemocytometer와 셀 수를 계산하여 결정) 만들기, 새로운 문화 매체를 추가합니다. 단계 1.1.13에서 설명한대로 새로운 60mm 직경의 문화 요리에 세포를 배포합니다. 참고 : 세포 배양 물은 이제 1 번 관절입니다 (P1). </li><li> confluency에 도달 한 후, 단계 1.2.1-1.2.5에서 설명한 동일한 절차를 사용하여 P1 문화를 P2로 subculture. P2 문화에서 60mm 직경의 문화 요리 대신 작은 문화 요리 (30mm 내경)에 세포를 뿌리십시오. </li><li> 실험을 위해서는 P2 또는 P3 배양 물을 사용하십시오. </li></ol></li></ol> 2. Thulium 레이저 조사 <ol><li> 조사 스테이션의 건설 <ol><li> 툴륨 레이저 장치 (1.94 μm, 전력 범위 : 0-20 W)를 0.22 NA, 365 μm 코어 직경의 광섬유에 연결하십시오. </li><li> 조사 스테이션의 수직 금속 포스트에 수평으로 고정 된 금속 팔에 섬유 팁을 기계적으로 고정합니다. 레이저 섬유의 끝이 세포 배양 접시가 조사하는 동안 배치되는 뜨거운 접시 위에 위치하고 있도록 수직 게시물을 놓습니다. </li><li> 핫 플레이트에 흰 종이를 놓고 조준 광선을 켜십시오 (λ = 635 nm, 최대 = 1 mW, 종이 레벨에서 지름 ≈ 30 mm). 백혈구에 조준 광선의 주위를 표시하여 배양 접시가 방사선 조사 중에 놓이는 위치를 알 수 있도록하십시오. 참고 : 섬유 팁의 z- 평면은 변경 가능할 수 있습니다. 추가 이미징 광학이 없으면, 세포 배양면의 레이저 스폿 직경은 섬유 팁 아래 12cm에 위치한다.약 30mm로 세포 배양 접시의 내경과 거의 동일하다. 설정의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" /> 그림 1 : 툴륨 레이저 조사 스테이션의 개략적 인 이미지. 배양 접시는 가열판에 놓는다. 세포는 트럼륨 레이저 섬유 팁 아래 12cm에 위치하여 빔 크기가 배양 접시 (약 30mm)의 내경과 거의 동일하게됩니다. 레이저 조사 절차는 맞춤형 시스템 설계 플랫폼의 시간 제어 루틴에 의해 제어됩니다. 조사 설정 프로그램을 시작하기 전에 전원 설정을 결정해야합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <olstart = &quot;2&quot;&gt; <li> 세포 배양의 레이저 조사 <ol><li> 조사 1 시간 전에, 배지를 완전히 새로운 배지 1.2 mL로 교체한다. 참고 : 이것은 중요한 단계이므로 엄격히 준수해야합니다. </li><li> 깨끗한 벤치에 조사 스테이션 ( 예 : 핫 플레이트 및 레이저 파이버를 고정 할 포스트)을 놓습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 꺼내 핫 플레이트의 표시된 위치에 놓습니다 (2.1.3 단계). </li><li> 보호 안경을 착용하십시오. 툴륨 레이저를 켭니다. 레이저 장치에서 원하는대로 전원을 설정합니다 (0 - 20W에서 조정 가능). 방출을 켜십시오. </li><li> 레이저 조사 및 타이밍 프로토콜 (보충 파일)을 제어하는 ​​시스템 설계 플랫폼을 시작하십시오. </li><li> 배양 접시를 핫 플레이트에 놓은 직후 &quot;pre-heating time&quot;을 클릭하여 140 초 동안 타이머를 시작합니다 ( &quot;예열 시간 1&quot;). 이것은 배지 온도를 3 ℃로 유지할 것이다.조사 전 7 ° C. 참고 : 140 초 후에 삐 소리가 켜지고 다음 타이머 ( &quot;예열 시간 2&quot;)가 자동으로 8 초를 시작합니다. 이 8 초 동안, 심사관은 문화 요리를 열 수 있습니다. 148 초의 예열 후, 세포 배양에 10 초간 레이저 조사가 자동으로 수행됩니다. 응급 상황이 발생하면 즉시 레이저를 멈추기 위해 레이저 장치에 강제 종료 버튼을 장비하십시오. 이것은 중요한 단계이며 반드시 지켜 져야합니다. 특별한주의 사항은 8 초의 예열 시간이 시작될 때, 조사 직전에 접시의 덮개를 여는 것과 관련이 있습니다. 덮개를 열면 매체 표면이 매우 빨리 냉각 될 수 있습니다. </li><li> 조사 후 즉시 문화 접시에 다시 커버를 놓고 추가 7 초 동안 뜨거운 접시에 문화 접시를두고 37 ° C 5 % CO 2 배양기에 다시 놓습니다. </li></ol></li><li> 온도 분포 측정세포 수준 (온도 교정) <ol><li> 세포가없는 30mm 직경의 배양 접시의 4면 (90 °마다)의 바닥에 가까운 작은 구멍 (직경 약 300 μm)을 만듭니다. 분젠 버너로 가열 한 바늘 (20G)의 끝 부분을 사용하십시오. 구멍을 외부로부터 절연 테이프로 밀봉하고 미세 바늘로 작은 구멍을 만들어 방수 조건에서이 구멍을 통해 미세한 열전대 (직경 200 μm) 만 삽입되도록하십시오. </li><li> 배양 접시 바닥면의 바깥쪽에 2 개의 수직 직경을 그리고 교차점 ( 즉, 바닥면 중앙)을 좌표 영 (0)으로 설정합니다. 선을 따라 각 방향으로 요리 ( 즉, 0, 3, 6, 9, 12 및 15 mm) 외부로 방사형으로 3 mm마다 표시합니다 ( 그림 2 , 파란색 점). 점수는 총 21 점이어야합니다. </li><li> 세포 배양 접시에 1.2 mL의 새로운 배지를 채 웁니다. 문화 d 배치37 ° C에서 핫 플레이트에 올려 놓고, 옆 구멍에 미세한 열전대 (직경 200 μm)를 삽입하고 표시된 민감한 팁을 측정 할 표시된 위치에 놓습니다. </li><li> 보호 안경을 착용하십시오. 툴륨 레이저를 켜고 레이저 장비의 전원을 수동으로 설정합니다 (0.1W 단위로 0W에서 20W 사이). 참고 : 온도 보정의 경우 전원을 3W 단위로 측정하면 충분합니다. </li><li> 시스템 설계 플랫폼을 켜고 &quot;Start Temp.Aquisition&quot;버튼 (보충 파일)을 클릭하여 온도 측정을 시작하십시오. </li><li> 2.2.6 단계와 동일한 절차를 수행합니다. 참고 : 제어 프로그램은 삽입 된 열전쌍의 온도를 100ms마다 측정하고 GUI에서 조사 도중 온도 진행을 표시합니다. </li><li> 21 개의 모든 측정 지점과 다른 전원 설정에 대해이 절차를 수행하십시오. 모든 포인트와 모든 파워 셋팅에 대해 전체 과정을 3 번 반복하십시오.신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수 있습니다. </li><li> 온도 데이터를 csv 데이터로 내 보내면 결국 스프레드 시트로 변환 될 수 있습니다. 각 포인트에서 3 회 측정을 위해 조사가 끝날 때 최대 온도를 평균화합니다. 동일한 원에있는 점의 평균값입니다 (중심점을 제외한 총 4 점). </li><li> 그래프에서 얻은 평균 최대 온도를 플롯하여 접시의 중심으로부터의 거리 (mm)를 x 축으로하고 온도 증가 (ΔT, ° C)를 y 축으로합니다. 수학적 소프트웨어 프로그램의 fit 함수를 사용하여 가우시안 모델을 원시 데이터에 맞 춥니 다. 가우스 피팅 온도 분포를 만듭니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" /> 그림 2 : 하나의 세포 배양 접시에서 온도 보정을위한 요점. 온도 데이터는 중앙 및 5에서 측정되었다.방사형 점 4 가지 각도 이상 (파란색 점). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 3. 열 방사선 조사 후의 세포 반응에 대한 생물학적 평가 <ol><li> 다양한 전원 설정 및 세포 사망 문턱치의 결정에 따라 세포 생존력 ( 즉, 생존, 세포 사멸 및 사멸) 평가 <ol><li> 표시된 시점 ( 즉, 방사선 조사 후 3, 24 및 48 시간)에 PBS (-)로 세포를 씻고 시판중인 키트를 사용하여 제조 회사의 지침에 따라 세포 생존력 ( 즉, 중요 세포, 사멸 세포, 죽은 세포)을 평가합니다. 실험 계획안. </li><li> fluorescein isothiocyanate (FITC) - anexin V 5 μL, ethidium homodimer III 5 μL, Hoechst 33342 5 μL를 1x binding buffer 100 μL에 첨가하여 염색 용액을 준비하십시오.구성 요소). 세포를 덮기에 충분한 염색 용액을 준비하십시오. 15 분 동안 세포를 품어. </li><li> 결합 버퍼로 두 번 세포 배양을 씻어 PBS (-)로 바인딩 버퍼를 교체하고 형광 현미경의 무대에서 문화를 설정합니다. </li><li> 빛의 경로를 접안 렌즈로 전환하고 4 &#39;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) 필터를 선택하고 조명 등을 켜고 4x 대물 렌즈로 초점을 맞춘 평면을 찾으십시오. </li><li> 카메라의 빛 경로를 변경하고 현미경 이미징 소프트웨어에서 컴퓨터 화면의 이미지를 찾은 다음 초점을 조정합니다. </li><li> 전체 세포 배양 접시의 형광 이미지를 얻기 위해 스티치 기능 ( 즉, 접시에 여러 이미지를 기록하고 단일 대형 이미지를 만드는 기능)을 사용하여 현미경 특유의 소프트웨어를 사용하십시오. DAPI, FITC 및 tetramethylrhodamine (TRITC)의 3 가지 필터 세트를 사용하여 Hoechst 33342 양성 세포 (모든 세포 핵), FITC-annexin V-positive 세포 (apoptotic), ethidium homodimer III- 양성 세포 (죽은 세포)가있다. </li><li> 죽은 (ethidium homodimer III 양성) 부위의 반경 (mm)과 염색 된 세포 배양에서의 apoptotic (annexin V- 양성) band-form 부위의 외경 / 내경을 측정하십시오. 해당 반경 설정 값에 맞는 온도 분포의 가우스 함수를 적용하십시오. 세포 사멸 및 세포 사멸 변화를위한 임계 온도를 명확히하기 위해 죽은 또는 apoptosis 영역의 림에서 정확한 온도를 계산하십시오. </li></ol></li></ol>

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	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

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온도와 관련된 생물학적 세포 반응을 논의 할 때, 대부분의 생화학 적 과정은 시간에 의존하기 때문에 온도뿐 아니라 증가 된 온도의 지속 시간도 중요합니다. 특히 안과에서 레이저로 유발되는 고열의 경우 밀리 초에서 초까지의 짧은 시간 범위로 인해 정확한 온도 제어로 세포 열 효과를 조사하기가 어렵습니다. 따라서, 세포 배양 모델 및 엄격한 온도 및 시간 제어를 가능하게하는 조작 시스템에 적합한 레이저 조사 장치가 요구된다. 단백질 발현이나 분비와 같은 열 노출 후 세포 반응의 생물학적 평가는 충분한 수의 영향을받는 세포에 대해 반복적으로 정량적 평가가 필요합니다. 이것은 임상 치료에서와 같이 직경이 수백 마이크로 미터 인 레이저 스폿을 사용하는 연구에 장애가되고 있습니다. 단일 레이저 지점에서의 정량 분석은 매우 유용합니다.rdensome. 이 연구에서는 가능한 한 이러한 요구를 충족시키기위한 시도가 이루어졌다. 조사 제어 프로그램과 함께 1.94 μm 파장의 연속파 두륨 레이저를 사용함으로써, 짧은 시간 내에 전체 세포 배양에서 일시적인 온도 상승을 수행 할 수 있었다. 온도 분포는 광 경로를 변경하여 조정할 수 있으므로이 설정을 사용하여 다양한 종류의 고온 관련 실험을 수행 할 수 있습니다. 제시된 기술의 한계는 세포의 레이저 조사 중에 동시 온도 측정을 수행 할 수 없다는 것이다. 열전쌍의 사용은 멸균 된 세포 배양에 적합하지 않기 때문에 온도 보정은 세포 조사와 별도로 수행해야합니다. 레이저 출력의 가능한 변화를 고려할 때 각 레이저 조사 중 실시간 온도 측정은 레이저 방사 출력에 해당하는 세포 반응을 직접 평가하는 데 이상적입니다.열 복용량. 또한, 여기에서 사용 된 온도 분포는 배양 접시상의 21 개 지점에서의 측정 및 몇몇 상이한 전력 설정에 기초한 데이터 보간을 통해 생성되었다. 따라서 이러한 한계점과 한계점을 극복하기 위해 레이저 조사가 진행되는 동안 배양 접시의 온도를 측정 할 수있는 대체 방법을 개발하는 것이 우리의 목표입니다. 우리는 또한 즉시 공간 온도 정보를 얻는 것을 목표로한다. 적외선 이미지 (열 화상)는 레이저 조사 중 온도를 측정하는 가능한 방법 중 하나입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 각 조사에 대해 세포 수준에서의 실시간 온도 측정입니다. 후속 세포 생물학적 반응은 조사 중 온도 이력과 항상 개별적으로 비교 될 수있다. 그러나 비용 효율성과 유용성을 고려할 때 셀 히터 실험을 위해 열 화상 사진을 사용하는 것은 모든 실험실에서 가능하지 않습니다오라이. 1.94 μm의 파장에서 툴륨 레이저를 사용하는 방법에서 세포 배양 접시의 물은 표면에서 가열되고 열확산과 대류는 세포를 가열하는 데 사용됩니다. 배양 배지 1.2 mL를 포함한이 조사 설정에서 배양 배지의 높이는 중심 위치에서 (광학 단층 촬영을 사용한 이전 측정에서) 935 μm입니다. 물 속의 툴륨 레이저의 흡수 수준은 매우 높습니다 (35 ° C에서 흡수 계수 : 127 cm -1 ). 그리고 빛의 72 %는 배양 배지의 첫 번째 100 μm에서 흡수됩니다. 935 μm의 깊이에는 거의 흡수가 없습니다 (0.0007 %). 프로토콜의 중요한 점 중 하나는 각 조사에 대해 동일한 양의 매체 (1,200 μL)를 추가하는 것입니다. 다른 양의 배양 배지를 사용하면 높이 차이가 생길 수 있으며 이로 인해 온도 차이가 발생할 수 있습니다.세포의 증가. 두 번째 중요한 점은 문화 요리가 열리는시기와 관련이 있습니다. 시스템이 소리를 낼 때, 조사 시작 8 초 전인이 연구에서 동시에 수행해야합니다. 이 타이밍의 차이는 주변 공기 (약 23 ° C)로 인한 냉각 때문에 기온이 달라질 수 있습니다. 이것은 레이저 유도 온도에 상당한 차이를 초래할 수 있습니다. 온도 보정을 위해, 실험에 사용 된 동일한 양의 배지 (1.2 mL)를 무 세포 배양 접시의 바닥에서 온도 분포를 측정하기 위해 사용 하였다. 그러나, 세포 단일 층을 갖는 중간 높이는 심지어 동일한 부피의 배지가 첨가 되더라도, 세포가없는 것보다 다를 수있다. 광학 단층 촬영기를 사용하여 측정 한 결과, 합류 세포 단층이 있거나없는 요리 사이의 중심 위치에 58 μm의 차이가 있음이 밝혀졌습니다 (세포가없는 877 μm,세포와 함께 935 μm). 이 차이는 잠재적으로 세포의 모세관 현상 때문입니다. 중앙 위치에서 높이의 58-μm 차이는 약 40 μL의 매개물 (측정 된 데이터)에 의해 야기 될 수 있습니다. 또한이 높이의 차이가 모든 출력 설정에서 Tmax 에 큰 차이를 일으키지 않았 음을 확인했습니다. 그러므로 우리는이 차이가이 연구에서 수행 된 분석 결과에 유의미한 영향을 미치지 않는다고 결론 지었다. 그럼에도 불구하고, 위에서 설명한 것처럼 더 정확한 온도 정보를 수집하려면 세포 단층이 들어있는 세포 배양 접시를 사용하여 온도를 보정하는 방법을 개발해야합니다. 또한 전체 배양 배지에서의 열 확산 및 대류에 대한 수학적 모델링이 필요합니다. 이 연구에서, 세포는 가우스 온도 분포로 가열되었다. 시간이 지남에 따라 매체를 더 균일하게 가열하는 몇 가지 가능한 방법이 있습니다. 하나<html> 물에서 흡수 계수가 낮은 레이저 소스를 사용하는 것입니다. 그러나, 단점은,이 경우, 레이저는 약 0.9mm 이상으로 흡수되는 광의 비율이 적기 때문에, 레이저는 더 높은 파워를 가져야한다는 것이다. 또 다른 가능성은 레이저 광을 배양 접시의 평면으로 전송하는 다중 모드 광섬유의 원위 섬유 팁을 이미지화하는 것입니다. 배율은 광학계에 의해 임의로 선택 될 수있다. 이 프로토콜의 두 번째 하이라이트는 생존 염색 및 측면 온도 분포의 형광 이미지를 사용하여 세포 죽음과 apoptosis에 대한 임계 온도를 결정하는 능력입니다. 장기적인 목표는 세포 생존력을 결정할뿐만 아니라 단백질 발현 및 세포 증식과 같은 세포 기능과 관련된 세포 생물학적 반응의 온도 범위를 밝히는 것입니다. 세포 사멸 역치 온도의 결정은 연구자들에게 큰 관심거리입니다이 방법을 사용하면 세포 사멸을 비롯한 세포 사멸의 주요 요인을 결정할 수있을 것입니다. 열 레이저 유도 세포 죽음의 중요한 요인은 온도 내역뿐만 아니라 내인성 요인을 통해 결정될 수 있습니다 ( 즉, 분자 수준에서의 세포 내 / 세포 외 요인) 이러한 질문에 대답하면 열 노출 후와 망막 병증이 다른 세포 사멸 기작과 동역학을 이해할 수있을뿐만 아니라 임상 적으로 관찰 된 문제를 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 레이저 치료에 대한 환자 간 개인차 또는 망막 광응고술 후 흉터 크기의 다양성과 같은 초기 스팟 크기가 거의 동일 할 때조차도 ( &quot;위축성 크립&quot;) 11 . 이 연구의 최종 목표는 망막의 온도 조절 광열 요법을 개발하는 데 도움을주는 것입니다. 이것을 달성하기 위해 병렬로온도 측정 3 의 기술적 진보,이 방법을 사용하여 결정된 열 노출 후 RPE 세포 행동의 추가 설명은 큰 이익이 될 것입니다.

온도 의존성 세포 생물학적 반응을 이해하는 것은 성공적인 고온 치료에 매우 중요합니다. 안과에서 사용되는 열 레이저로 망막 레이저 광응고술은 의학에서 가장 잘 알려진 레이저 치료법 중 하나입니다. 주로 녹색에서 노란색 파장의 가시 광선이 망막 레이저 치료에 사용됩니다. 빛은 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 멜라닌에 의해 많이 흡수되며 망막의 최 외각 세포 단층을 형성합니다. 여러 종류의 망막 장애에 대한 새로운 치료 전략으로 매우 가벼운 열 방사선 (sub-visible photocoagulation)에서 의사와 연구자들 사이에 최근의 관심이있었습니다 1,2 . 이러한 추세에 따라, 우리의 관심은 온도 조절 광열 요법 (TC-PTT)이라는 정확한 온도 조절하에 RPE 세포를 치사 적으로 가열하는 것에 있습니다. 최근 옵토우리 연구소의 음향 기술은 망막의 조사 된 부위에서 온도 증가를 실시간으로 측정 할 수있게 해주었습니다. 이로써 조사 중 온도 상승을 제어 할 수 있습니다 3 . 그러나 온도를 측정하고 조절할 수 없기 때문에 RPE 세포를 준 사염 적으로 가열함으로써 망막의 치명적이지 않은 고열이 이전에 고려되지 않았기 때문에 열 레이저 조사 후 RPE 세포의 온도 의존 세포 반응은 지금까지 연구 된 적은 거의 없다. 더욱이, 온도차는 상세하게 논의되지 않았을뿐만 아니라 준 치명적 및 치명적 조사 후에 살아남은 세포의 세포 행동의 차이도 또한 상세하게 논의되지 않았다. 따라서 TC-PTT 기반 치료법에 대한 과학적 증거를 수집하기 위해 우리는 온도 의존적 ​​인 RPE 세포 생물학적 반응 및 시험 관내 실험 장치를 사용하여 그 기전을 밝혀내는 것을 목표로한다. t그의 목적은 다음과 같은 조건을 충족시키는 세포 가열 장치를 확립하는 것이 필요하다 : 1) 빠른 온도 증가 가능성, 2) 정확한 시간 및 온도 제어, 3) 생물학적 실험을위한 비교적 많은 수의 검사 세포 . 가열 방법과 관련하여, 주파수가 두 배로 증가한 Nd.YAG 레이저 (532 nm)와 같은 임상 레이저는 불행히도 세포 배양 가열에 적합하지 않습니다. 이는 배양 된 RPE 세포에서 멜라노 좀의 수가 크게 감소했기 때문입니다. 레이저 광 흡수는 불균일 할 수 있으며 세포 수준에서의 온도 증가는 동일한 복사 전력으로 조사 된 경우에도 실험간에 가변적입니다. 몇몇 이전의 연구는 실험 5 , 6 전에 배양 세포에 의해 탐식 된 추가 멜라노 좀의 사용 또는 조사 4 동안 접시 바닥 아래에 검은 종이의 사용을보고했다. 많은온열 플레이트, 수 욕조 또는 온도 설정이 7 인 CO2 배양기를 사용하여 고열로 유발 된 세포 반응을 평가하기위한 시험 관내 생물학적 연구가 수행되었습니다. 이러한 방법은 원하는 온도에 도달하는 데 약간의 시간 ( 즉, 몇 분)이 걸리므로 가열 시간이 길어야합니다. 또한, 이러한 방법을 사용하면 세포 수준에서 상세한 열 이력 (시간에 온도를 곱한 값)을 얻는 것이 어렵습니다. 또한, 하나의 배양 접시에서 상이한 위치의 세포들 사이의 온도는 가변 온도 확산으로 인해 다를 수있다. 생물학적 세포 반응이 온도의 증가와 온도의 지속 시간에 의해 결정적으로 영향을받을지라도, 대부분의 경우 고온 치료 중이 시간 및 공간 온도 정보는 생물학적 분석을 위해 고려되지 않았습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 conti여기에 nuous-wave thulium 레이저를 사용하여 세포를 가열했다. 툴륨 레이저 방사 (λ = 1.94 μm)는 물에 의해 강하게 흡수되며, 배양 접시의 바닥에있는 세포는 열확산을 통해 단독으로 열 자극을 받는다. 365-μm 직경의 레이저 섬유는 배양 접시 위에서 약 12cm 위에 놓았으며 그 사이에는 광학 장치가 없습니다. 레이저 광선의 직경은 배양 접시 표면의 배양 접시 (30mm)의 내경과 거의 동일하게 발산한다. 배양액의 양이 일정한 경우 세포의 온도 상승을 조사 할 수있다 높은 반복성. 가변 출력 설정은 최대 20W의 조사가 가능하며 세포 수준의 중간 온도는 10 초 동안 ΔT ≈ 26 ° C까지 증가 할 수 있습니다. 조사 조건을 변경함으로써, 레이저 빔 프로파일을 변경하여 온도 분포를 변화시킬 수있다문화 요리에. 예를 들어, 현재의 연구 에서처럼 가우스 형태의 온도 분포로 또는 균질 한 온도 분포로 조사하는 것이 가능합니다. 후자는 치명적이지 않은 온도 증가에 대해서는 온도 의존성 세포 반응의 효과를 조사하는데 유리하지만 세포 사멸 스트레스 또는 상처 치유 반응에는 유리하지 않을 수있다. 전체적으로, 툴륨 레이저 조사는 상이한 열 노출 후에 유전자 / 단백질 발현, 세포 사멸 동력학, 세포 증식 및 세포 기능 발달과 같은 여러 종류의 생물학적 요인을 조사 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

생물학적 평가를 위해 1.94 μm 연속파 툴륨 레이저를 사용하여 배양 된 세포를 가열하는 독창적 인 방법을 소개합니다. 툴륨 레이저 방사는 물에 강하게 흡수되며 배양기 바닥의 세포는 열 확산을 통해 가열됩니다. 365 μm의 직경을 가진 레이저 섬유는 배양 접시의 약 12 ​​cm 위에 놓여 있으며, 레이저 빔 직경은 배양 접시 (30 mm)의 내경과 거의 동일합니다. 각 실험에서 일관된 양의 배양 배지를 유지함으로써 재현성 높은 온도 증가로 세포를 조사 할 수 있습니다. 각각의 파워 세팅을 위해 하나의 세포 배양 접시에서 온도 증가 및 그 분포를 보정하기 위해, 온도는 상이한 위치 및 세포 수준에서 10 초 동안 조사되었다. 온도 분포는 수학 그래픽 소프트웨어프로그램, 문화 격판 덮개의 맞은 편에 그것의 본은 가우스 모양에서이었다. 레이저 조사 후, 온도 의존성 세포 반응을 평가하기 위해 상이한 생물학적 실험을 수행 할 수있다. 이 원고에서 생존 염색 (생존, 세포 자멸 및 사멸 세포 구별)은 시간 경과에 따른 세포 사멸 및 사망의 역치 온도를 결정하는 데 도움이됩니다. 이 방법의 장점은 전체 세포 배양 접시에서 가열 세포의 고효율뿐만 아니라 온도 및 가열 시간의 정확성입니다. 또한, 컴퓨터 운영 체제로 잘 제어 할 수있는 다양한 온도 및 시간 간격으로 학습 할 수 있습니다.

다양한 전원 설정 후 온도 분포 각 단일 조사에 대한 모든 온도 변화는 온도 보정에서 모니터링되었습니다. 이 데이터로부터 측정 된 점에서 최대 온도가 구해지고 T max (℃)로 정의됩니다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 배양 접시가 가열판에 놓인 시점에서 프로그램을 수행 하였다. 37 ° C에서 안정된 중간 온도를 보관하는 데 필요한 140 초의 &quot;예열 시간 1&quot;후 8 초의 예열 시간 2 동안 배양 접시의 덮개가 제거되었습니다. &quot;예열 시간 2&quot;가 끝나면 레이저 방출이 자동으로 시작됩니다. 이 곡선은 10 초 조사의 대표적인 온도 진행입니다. 조사 동안, 온도는 증가하였고, 레이저 방출 직후꺼지면 온도가 내려 가기 시작했습니다. 배양 접시의 중심에서 최대 온도는 본 연구에서 T max (℃)로 정의되었다. T max 는 레이저 출력에 비례한다 ( 그림 3B ). 도 3C 는 배양 접시에 걸친 각 힘의 최대 온도 분포를 나타낸다. 분포는 도 3c에 도시 된 바와 같이 종형이며, 다음 식에 따라 가우스 함수에 적합하다 : t (r) = tbase + A · <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54326/54326eq1.jpg" /> 여기서 r, t base , A 및 w는 중심에서의 거리 (mm), 곡선의 최저 온도, 진폭 및 곡선의 폭을 나타냅니다. 장착 된 G의 파라미터 (t base , A, w)각 전력 설정에 대한 aussian 곡선, 즉 각 T max 에 대한 그래프가 그래프 옆의 테이블에 표시됩니다. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig3.jpg" /> 그림 3 : 온도 보정 데이터. 4.9 W (T max = 43 ° C)의 단일 조사 후 중심 위치에서의 대표 온도 발달 ( A ), 세포 배양의 중심 위치에서 레이저 출력과 최대 ΔT 사이의 비례 관계, 및 다른 온도 설정 (C) 후 문화 요리에 걸쳐 온도 분포. (A) 배양 접시가 가열판에 놓인 시점부터 프로그램을 수행한다. 37 ° C에서 안정적인 중간 온도를 보관하는 데 필요한 &quot;예열 시간 1&quot;의 140 초 후에 배양 접시의 덮개가 8 초의 예열 시간 동안 제거됩니다2. &quot;예열 시간 2&quot;가 끝날 때 레이저 방출이 자동으로 시작됩니다.이 곡선은 4.9W에서 10 초간 조사하는 동안 중심 위치에서 대표적인 온도 진행입니다. 조사 중 온도가 상승하고 레이저 방출이 꺼지 자마자 온도가 감소하기 시작한다. 최대 온도는이 연구에서 T max (℃)로 정의 된 조사의 끝에서 얻어진다. (B) 레이저 출력과 최대 온도 증가 (ΔT max )는 비례 함 (C) 배양 접시에서 측정 된 온도 분포의 가우시안 함수 수학적 소프트웨어 프로그램으로 결정된 함수의 매개 변수는 그래프 옆의 표에 나와 있습니다 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 열 조사 후 세포 생존율 도 4a에 도시 된 바와 같이, 레이저 조사 후 세포 생존 능력을 나타내는 3 가지 상이한 염색 패턴이있다 : 1) 아네 신 V / 에티 디움 호모 다이머 III- 양성 ( 즉, 단지 생존), 2) 아 넥신 V- 양성 ( 즉, 거의 오직 초기 세포 사멸), 그리고 3) 죽은 세포와 살아있는 세포 사이의 경계에서 세포 사멸 세포로 둘러싸인 중심 ( 즉, 죽은 세포)에서의 에티 디움 호모 디머 III 양성 ( 그림 4B ). 죽은 / 아폽토시스 영역의 크기는 일반적으로 T max 와 조사 후 48 시간까지의 조사 후 시간에 좌우된다. T max가 43 ℃ 이하로 조사 된 배양 균에서 생존력의 변화는 발견되지 않았다. 유일한 apoptotic 변화는 시간 (3 시간)의 초기에 관찰 될 수 있었고, 늦은<html> T max = 47 ° C의 조사 후 세포 사멸. T max ≥ 51 ° C (표 1)로 조사 된 배양 물에서 즉각 또는 초기 세포 사멸 (최대 3 시간)이 발견되었다. <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig4.jpg" /> 그림 4 : 다른 전원 설정 (A) 후 치명적인 얼룩의 패턴과 치명적인 레이저 조사 후 죽은 자의 림 (Apoptotic Area)에서 모범적 인 이미지 (B). (A) 온도에 따라 3 가지 염색 패턴이 발생할 수 있습니다. (B) 죽은 지역 (ethidium homodimer III- 양성 : 적색) 주변의 apoptotic zone (FITC-annexin V- 양성 : 녹색). 모든 세포는 Hoechst 33342 (파란색)에 대해 양성이며 파란색 핵을 가진 세포는 살아있는 세포입니다. 이미지는 T max = 59 ° C에서 조사 후 24 시간 동안 촬영되었습니다. 막대 = 100 μm./files/ftp_upload/54326/54326fig4large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54326/54326tbl1.jpg" /> 표 1 : 다양한 온도와 시간에서 Annexin V와 Ethidium Homodimer III 반응. 세포 사멸을위한 역치 온도 결정 죽은 지역 (적색)과 apoptotic 지역 (녹색)의 평균 반지름은 온도 분포의 가우스 함수에 측정하고 10 초 방사선 조사 후 세포 죽음과 apoptosis에 대한 임계 피크 온도를 결정하기 위해 적용되었다. 이 분석에 따르면, 조사 후 3 시간, 24 시간 및 48 시간의 완전한 세포 사멸의 평균 임계 온도는 각각 54.0 ℃, 50.9 ℃ 및 50.1 ℃였다. 평균 thresho51.7 ℃, 48.0 ℃ 및 47.0 ℃에서 각각 3 시간, 24 시간 및 48 시간 동안 임계 온도와 함께 세포 아폽토시스 변화에 대한 온도는 약 2 - 3 ℃ 낮아졌다 ( 그림 5 ). <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig5.jpg" /> 그림 5 : 아폽토시스 및 세포 사멸을위한 임계 온도. 형광 현탁액의 염색 결과로부터 계산 된, 완전한 세포 사멸 (Hoechst 33342, annexin V 및 ethidium homodimer III에 대한 양성) 및 방사선 조사 후 상이한 시점에서의 세포 사멸 (Hoechst 33342 및 annexin V에만 양성)에 대한 평균 임계 온도 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

1.94 μm 연속파 레이저 방사를 사용하여 배양 접시에서 세포를 가열하는 독창적 인 실험 장치를 소개합니다. 이 방법을 사용하여 다양한 열 노출 후 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 생물학적 반응을 조사 할 수 있습니다.

배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

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Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

연구

생물학

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

교양있는 세포 기관 전송<em&gt; 초파리</em&gt; 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...