We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

유리 Coverslips는 1. 준비 <ol><li> 에탄올을 모두 커버 슬립의 총 노출을 보장하기 위해 때때로 교반하면서 적어도 10 분 동안 70 % 에탄올에 담가들을 커버 글라스 원형 12mm 직경 소독. 무균 세포 배양 접시에 커버 글라스와 에탄올을 붓고 (중 6cm 또는 10cm 직경). </li><li> 멸균 미세 5B 집게 한 쌍의 픽업과 24 잘 클러스터 판의 우물에 각각의 유리 커버 슬립을 배치합니다. 커버 슬립이 잘의 측면을 감동과 잘의 중간에 약입니다되지 않도록주의하십시오. </li><li> 흐름 캐비닛에 건조 커버 글라스와 유엔 덮인 24 아니라 클러스터 판을 둡니다. 이 약 10 분 소요 </li><li> 이 기간 동안 0.1 ㎎ / ㎖에 행크 평형 염 용액 (HBSS)에 10 ㎎ / ㎖ 인간 피브로넥틴 희석하여 도포 혼합물을 준비한다. </li><li> 커버 슬립은 건조되면, 각 공동 유리 상 코팅 용액 100 μL 피펫그래서 verslip 솔루션은 물론 외부의 주위에 풀링없이 만 유리를 포함한다. 시간 이상 세포 배양 인큐베이터에 덮여 24 잘 클러스터 판을 놓습니다. </li><li> 사용 직전, 코팅 용액을 제거한다. 동일한 코팅 용액은 멸균 튜브에 옮기고 효능의 눈에 보이는 손실이 세 번까지 사용할 수있다. </li></ol> 내피 세포 단일 층의 2 준비 <ol><li> 37 ° C에서 중간 및 5 % 이산화탄소에서 배양 인간 동맥 내피 세포 (EC). </li><li> 문화 미디어를 대기음 10 ml의 HBSS와 EC 단일 층을 씻어 </li><li> HBSS 대기음 및 추가 2 ml의 0.5 % 트립신, 0.2 % EDTA 솔루션입니다. 약 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> EC는 플라스크의 측면에 탭에 의해 탈락 할 수있는 경우, 대두 트립신 억제제의 5 mL를 추가하고 피펫으로 상기 셀을 제거하기 위해, 플라스크의 표면 물총. </li><li> 15 ML 튜브와 원심 분리기 튜브에 세포를 전송5 분 200 XG에. </li><li> 뜨는 대기음 미디어 5ml에 EC 펠렛을 재현 탁. 혈구와 세포를 세어 EC 미디어 ml의 당 50,000 EC에 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 피복 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 분배. 37 ° C 플러스 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 세포 O / N을 부화. </li><li> 합류 단층를 3 일 내에 형성되는 경우 세포는 실험에 사용하기위한 준비가되어있다. </li></ol> 단핵구 3. 준비 <ol><li> RPMI에서 배양 전송 HL-60 세포를 15 ml 튜브에 현탁 배양으로, 10 % 우태 혈청으로 보충. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 5 ml의 배지에 재현 탁하고 세포 상등액을 제거하고 2 백만 세포 / ml로 미디어 세포 농도를 조절한다. HL-60의 형광 라벨을 원하는 경우, 혈청없이 RPMI PR에 세포를 재현 탁4 절에 설명 된대로 oceed. </li><li> 1과 3 사이의 시간의 선택 일정 기간 EC 단층을 함유 24 웰 클러스터 플레이트의 각 웰에 HL-60 세포 현탁액 0.5ml를 추가하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 부화 시간. 약간의 차이가 바인딩 포화가 달성 1 시간과 3 시간의 시간 점 사이에 관찰된다. </li><li> 세포 세척 / 수확 준비 : HBSS 100 ml의 120 ML 튜브를 입력합니다. 새로운 24 웰 플레이트의 각 웰에 포르말린 1 mL로 분배. </li><li> 를 만지지 않도록주의하면서 잠복기 후, 날카로운 집게의 쌍을 사용하고 우물에서 유리 커버 슬립을 선택하고 수직 커버 슬립을 누르고 3 초 동안 벤치에 조직의 조각에 커버 슬립의 가장자리를 가볍게 두 드리 조직과 커버 슬립의 세포 덮인 표면. </li><li> 포셉 한 쌍 단단히 커버 슬립을 잡고 및 HBSS 다섯 번에서 커버 슬립 덩크. </li><li> 다섯 번째 덩크 후HBSS에서 3 초 동안 조직에 커버 슬립의 가장자리를 두드려. </li><li> DAB 다음 5 덩크 세 세트의 총을, 3.6 및 3.7에 설명 된 덩크와 뿌리며 마치 절차를 반복합니다. </li><li> 실온에서 세포를 해결하기 위해 잘 포함 10 % 포르말린에 커버 슬립을 전송합니다. 커버 슬립은 열거에 대한 준비가 장기 저장 또는 아래에 설명 된 다른 절차를 실시한다. </li></ol> 세포 추적기와 HL-60 세포의 4. 라벨 (선택 사항) <ol><li> 개수 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 HL-60 세포 (예를 들어, 1000 만) 적당량 옮긴다. 원심 분리기 HL-60 5 분 200 XG에 세포. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 백만 세포 / ml의 농도에서 혈청없이 RPMI 배지에서 세포 추적기에 재현 탁 된 세포 펠렛. 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 품어. </li><li> 200 XG에 원심 분리기 세포 5 분 동안 상층 액을 버린다. 2,000,000 (C)의 농도로 배지에서 재현 탁 된 세포 펠렛ELL 학생 / ㎖. </li><li> 유리 커버 슬립에 성장 각 웰에 들어있는 내피 세포에 세포 추적기 표지 HL-60의 0.5 ML을 추가합니다. 3.3에서 계속합니다. </li></ol> 접착제 내피 세포의 5 열거 <ol><li> 현미경 개별 세포를 식별하기 위해 DAPI 반대 얼룩 슬라이드에 마운트 된 커버. </li><li> 4 배 또는 10 배 목적으로 거꾸로 현미경을 사용하여, 여러 분야 (예를 들어, 5 필드)의 이미지를 획득하고 유엔 조사 내피 세포에 집계 단핵구의 가장 높은 수를 (이것은 일반적으로 3-5이어야 함) 계산합니다. </li><li> 내피 세포에 단핵구의 임계 값으로 두 번이 번호를 설정 그 클러스터로 정의한다. 필요한 경우, 다른 기준은 실험의 성질에 따라 클러스터를 정의하는데 사용될 수있다. </li><li> 클러스터의 개수 및 필드 내피 세포의 개수를 카운트. 접착제 내피 세포의 비율을 얻기 위해, 후자가 전자를 나눈다. 점수다수의 필드 카운트의 평균 및 표준 편차를 얻었다. </li></ol> 항체 6.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석법 및 세포를 RT에서 15 분 동안 10 % 포르말린으로 고정 된 후에, 표준 절차 (10) 및 원하는 항체를 사용한 면역 형광에 커버 슬립 대상. </li><li> 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제의 활동 7.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석 및 세포 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 활성을 15 분, 얼룩을 위해 포르말린에 고정 된 후 염색 키트와 함께 제공되는 사용 설명서의 설명에 따라. 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

상술 단핵구 접착 분석은 내피 단층 (10) 위에 전리 방사선의 생물학적 효과를 연구하기위한 실험에 성공적으로 사용되었다. 이것은 내피 단층의 접착 성을 평가하기 위해 사용할 수있는 유일한 방법은 아니지만 점착성 단일 층 내의 비율 또는 내피 세포의 비율의 정량을 허용하는 유일한 방법이다. 이 단핵 세포의 접착 글로벌 양적 변화로서 중요한 차이이며, 다른 방법에 의해 측정 한 내피 단층 또는 내피 세포의 서브 모집단의 증가 접착 모든 세포 접착 일반 상승를 기인 할 수있다 단일 층 내에서,로 위의 예에서와 같이. 이러한 정보를 갖는 값이 조사되었다 이네스 후 향상된 접착 능력을 나타내 내피 세포의 백분율을 정량화하는 사실에 의해 예시이 효과는 접착했다 세포의 비율과 같은 특정 유전자의 유전 적 변이로 인해 아니라고 할 결론은 선량 X-방사선에 의해 유전자의 무작위 돌연변이으로부터 예상되는 것을 (1000 회 이상)의 상술 크게했다 . 결과의 재현성을 가능 요소는 세척 제도이다. 세척 절차는 조직에 뿌리며 마치 다음 세척 완충액으로 유리 커버 슬립의 침적을 수반 같이, 필연적 웰로 세척 완충액의 피펫의 이전 방법에서 발생 버퍼 난류의 변동은 회피된다. 실제로 이는 세척 단계에서 변동 요소를 제거 세척 과정을 고안하라고 강요 피펫 팅 방법을 사용하여 수득 복제 사이의 과도한 변동이 관찰되었다. 틀림없이, 필요로하는이 분석 거짓말의 한계는 N 할 단핵구 클러스터의 수동 계산을 수행하기 위해OT는 높은 처리량 분석을 위해 적응 될 수 있도록. 둘째, 많은 단핵구는 클러스터를 구성하는 방법에 대한 결정은 세미 임의로 결정되어야하고 레벨이 너무 높게 설정 및 일부 정품 클러스터 제외 초래할 수있다. 이 방법에서의 전단력의 부족은 또한 혈관 내피 세포의 접착 성이 크게 개선 된 유도되는 실험 (예를 들면, + TNFα)의 한계로 볼 수있다. 이 접착 덜 과장된 보강의 검출을 허용하는 다른 상황에서는 그러나, 전단력의 부족 장점이다. 단핵 세포 접착에 겸손한 증가가 특히 중요하고 관련이있을 수 있습니다. 생체 내, 단핵 세포는 (일반적인 실험 시간에) 힘을 전단 크게 인해 접착에 겸손한 증가와 내피 세포에 큰 숫자에 첨부 할 것으로 예상되지 않는다. 시간 그러나, 일부 단핵구 아마 것, 이것은 만성 염증의 환경을 나타낼 가능성이 높습니다. 이와 같이,이 접착에 겸손 증가 전단 응력으로 관찰 할 수 있도록 일반적으로 짧은 가능성이 너무 덧 ​​있습니다 실험 시간 프레임에서 공개 될 내피 세포 접착에 작은 증가를위한 기회를 제공하기 때문에 전단력의 부재는 장점이 될 수 있습니다. 위의 증명으로 특정 세포 단백질이나 세포의 상태에 특정 내피 세포의 접착의 연결을 허용하는 등 노화 분석 및 면역 형광 염색 등의 분석이 분석 한 후 세포를 대상 수있는 능력은, 기능을이 방법의 유용성을 증가하는 이전 접착 분석을 사용할 수 없습니다. 이 방법은 est2 - 불멸화 인간 동맥 내피 세포와 비슷한 결과가 사용되고 또한 단지 특정 세포주 특정 아니라고 보여주는 차 인간 동맥 내피 세포 (10)를 얻었다. 또한, ADO내피 세포의 접착 성을 분석하는이 방법의 ption 레이블 면역 세포의 형광을 측정하는 표준 접착 분석에 동일한 세포를 실시 배제하지 않는 것으로 이해되어야한다. 함께,이 보고서는이 방법이 포함 다양한 표준 접착 분석보다 더 많은 정보를 제공하는 것을 보여줍니다.

이러한 혈관 내피 세포 라인 층 전체 단핵구와 같은 면역 세포 침윤은 염증 하나의 과정에서 중요한 단계이다. 이 부상의 사이트에 면역 세포 (면역 세포)의 원점 복귀를 할 수 있습니다. 이러한 관상 동맥 및 경동맥 다른 인스턴스와 지역에서는 내피 층을 통해 단핵 세포의 침윤은 잠재적 플라크 (2)의 형성으로 이어지는 동맥의 벽에 이들 세포의 바람직하지 않은 장기 체류가 발생할 수있다. 면역 세포 침윤의 모든 경우에서, 첫 번째 단계는 혈관의 국부적 인 영역에서의 내피 세포의 활성화를 수반한다. 내피 세포 등의 내피 세포 표면 3- 상 면역 세포의 모집 및 부착을 용이 예컨대 VCAM, ICAM 및 E 셀렉틴과 같은 세포 표면 단백질의 발현을 증가시키기 TNF-α 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨에 의해 활성화된다 6. 7 내피 부착 단핵구를 계산함으로써 수행 하였다. 정밀도의 관점에서 이러한 방법의 한계는 림프구 또는 단핵구 밀착성 4에 대응 방사성 물질의 정량 하였다 무선 표지 된 림프구 또는 단핵구의 사용되었다. 이 방법은 결국 8 측정된다 관심 면역 세포가 차분 대신 방사능의 형광되고있는 상기와 같은 방법으로 형광 염료로 표지 하였다하고있다 형광 계 방법에 의해 대체되었다. 현재이 방법은 가장 편리한로 떠오르고있다 몇몇 상업 공급 업체 키트 형태로 판매되고있다. 이 분석은 제어 및 실험 샘플 사이의 밀착성의 상대적인 수준을 측정 할 수 있지만, 형광의 변화가 전체에 걸쳐 예를 접착 일정한 변화로 인한 것인지 공개하지 않는다ndothelial 세포군 또는 변화로 인해 세포의 하위 집단 내 밀착성의 차이 인 경우. 그것은 세정 엄격함이 결과에 큰 효과를 발휘하고, 더욱 중요한 것은, 다른 내피 세포 단층 사이의 결합되지 않은 단핵구를 헹굼 균일 샘플 사이 결과 복제 결과의 근접성 및 재현성에 큰 영향을 줄 수 있음도 분명하다 . 최근에, 내피 세포 단층에 걸쳐 미디어에 단핵구 펌프 몇몇 시스템에서는이 문제를 해결하기 위해 구를 사용 하였다. 또한, 이러한 플로우 시스템은 또한 내피 세포상의 전단력의 영향 요점을 되풀이. 이러한 시스템의 장점은 명확하고 매우 매력적이지만 급성 염증의 경우와 같이, 그러한 같은 전리 방사선 등 TNFα, 다른 활성제와 같은 요인들에 의해, 내피 세포 접착 성이 크게 증대 될 수있는 동시에 실현하는 것도 중요 10 야기가 T는 변경모자는 쉽게이 매우 엄격한 시스템에 의해 체외 실험 시간 프레임 내에서 검색되지 않습니다. 내피 세포 접착 이러한 미세한 변화를 쉽게 놓친 또는 시험 관내에서 기각 반면, 만성 염증의 특성 인 수명, 내 같은 작은 변화가 매우 심각한 결과를 발휘할 수있는 생체 내에서 반드시 양성 아니다. 따라서 강력한, 아직 민감하고 구체적인 방법 감지하고 내피 세포 접착이 필요한 측정합니다. 여기서는 직접 내피 세포의 접착 성을 측정하는 방법을보고한다. 이 방법은 내피 세포 접착의 대리 지표로서 간접 형광 측정에 의존하지 않는다. 그것은 접착의 변화가 모든 셀에 걸쳐 균일 한 변화로 인해 또는 하위 집단에 국한 여부를 알 수있다. 또한, 이러한 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제, 세포 생존력 마르 마커 내피 세포의 공동 - 염색을 허용KER, Calcien 오전 및 특정 세포 상태 또는 특정 단백질의 발현 개별 접착제 내피 세포의 연결을 허용하는 세포 표면 및 세포 내 단백질에 대한 항체.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

염증의 기본적인 프로세스 중 하나는 주변 조직에 혈관의 내강에서 면역 세포 침윤이다. 혈관 라인 내피 세포, 예컨대 단핵 세포로 면역 세포 순환에 접착 될 때 발생한다.이 밀착성의 시험 관내 측정 이제 직접 카운트로 어느 내피 층에 부착 단구의 총 수를 정량함으로써 수행 될 때까지 또는 부착 된 단핵 세포의 형광의 간접적 인 측정에 의해. 이러한 측정은 내피 세포 집단의 평균 접착 성을 표시 할 수 있지만, 그것들은 예컨대 셀 번호 등과 같은 여러 요인들에 의해 혼동되고, 실제로 접착되어 내피 세포의 비율을 공개하지 않는다. 여기에 우리가 설명하고 내피 세포 단층의 테스트 인구 내에서 접착 세포의 열거를 할 수있는 방법을 보여줍니다. 내피 세포는 커버 글라스에 성장하고 원하는 다음처리 (즉,이 형광 표지 할 수있다) 단핵구와 도전. 침지 및 배수 여러 발사 관련된 인큐베이션, 세정 절차 후, 세포를 고정한다. 단핵 세포에 의해 둘러싸여있다 접착제 내피 세포는 용이하게 식별되고 접착제이다 모집단 내의 내피 세포의 실제 비율을 보여준다 부착 인덱스를 부여 열거된다.

이 방법은 모집단 내의 개별 접착제 내피 세포의 검출을 허용한다. 예를 들어, 유엔 조사 내피 세포의 단층은 (이전에 개별 내피 세포 주위 클러스터에서 단핵 세포에 의해 구속 된 단핵 세포와 배양에 칠일 후 10Gy의 조사에서 배양 및 세척, 내피 세포 단층 다음과 같은 몇 산발적 HL-60 단핵구를 유지하면서 그림 1). 이 현상은 위상차 현미경 하에서 용이하게 관찰 할 수 있지만, 형광 현미경은 단핵구 클러스터에도 선명한 영상을 보여준다. 기재된 접착 분석을 수행 한 결과, 표준 면역 형광 방법에 적합한 항체를 사용하여 막, 세포질 또는 핵 (도 2)에 대해 단백질을 세포 염색을 진행하는 것이 가능하다. 또한, 같은 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제 (그림 3)와 같은 효소 기반의 분석은 또한 PE 될 수 있습니다rformed. 각 단핵구 클러스터 개별 내피 세포에 상당하기 때문에, 클러스터 열거 단층 내의 접착제 내피 세포의 실제 수를 공개한다 (도 4), 및 인구 내의 접착제 내피 세포 따라서 비율 (표 1,도 6) . 이 내피 세포 접착의 이러한 정량화 할 수 있습니다 지금까지 유일한 방법입니다. 그것은 여기에서 실험에 사용 내피 세포는 접촉 억제하고 합류 달성 후에 수가 증가하지 않는다는 것을 주목할 필요가있다. 이것은 나중에 포인트 증가 내피 세포 수로 인한 잠재적 인 복잡성을 제거합니다. 원한다면, 내피 단층 부착 단핵구 (3.9 대신 고정) 0.5 % 트립신 0.2 % EDTA 용액에 의해 탈락 할 수 있으며 현대 법의 경우 (도 5)와 같이 그 형광, 플레이트 판독기를 사용하여 측정. </P&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> 내피 세포의 단층에 단핵구의 그림 1. 접착. 미 조사 된 내피 세포는 단핵구는 산발적으로 랜덤 방식으로 개별 셀 (패널 왼쪽)와 같은 사후 10 Gy를 조사 7 일 개별 내피 세포에 클러스터에 부착 된 단일 층 (오른쪽 패널). 낮은 패널은 위상차에서 볼 수있는 작은 밝은 구형 세포가 실제로 세포 추적기 녹색 미리 라벨링 된 단핵 세포임을 확인 상단 패널의 형광 이미지입니다. 단핵구 클러스터의 일부는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 촬영 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> 단백질 후 접착 분석을위한 내피 세포의도 2 염색법은. 바와 접착 분석을 수행 한 후, 커버 글라스의 셀 (A) 막 단백질의 검출 (CD44)에 대한 면역을 실시하고, b) 세포질 단백질 (튜 불린) 또는 c) 핵 단백질 (γ-H2AX). (A)와 쇼 단핵구 세포 추적기 녹색과 오른쪽 패널에 비슷한 이미지 미리 라벨링 (20X의 목적으로 본) (B)의 왼쪽 패널은 CD44과 미세 소관 (적색) 및 DAPI 염색 핵 (파란색)를 알 수있다. γ-H2AX에 대한 항체로 염색 한 조사 내피 세포의 핵에 (C) 지점에 흰색 화살표. DAPI로 밝은 청색 염색 단핵구 핵 쉽게 내피 세포의 핵 타원형 구별된다. 이미지는 20 배 목표로 촬영했다.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> 내피 세포에서 알 수있는 바와 같이 내피 세포의 그림 3. 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 염색. 접착 분석 한 후, 커버 슬립에 세포, 노화 세포의 리소좀이 파란색으로 원인이 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제를 위해 염색을 실시 하였다 그 선택적으로 인해 작은 크기와 구형 쉽게 식별 다수의 단핵 세포에 의해 바인딩됩니다. 20X 목표를 통해 본 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; 개개의 내피 세포에 단핵구 클러스터도 4 열거. 접착 분석 한 결과, 세포의 이미지는 여러 다른 위치 식별 및 단핵구 클러스터에서 촬영하고, (녹색) 원. 클러스터는 내피 세포에 10 이상의 단핵구의 응집으로 정의 하였다. 이미지의 단핵 세포 클러스터와 십이일 후 조사 내피 세포의 수의 수 (빨간색 점선)를 계산하고, 계산 부착 내피 세포의 비율이 10 배 목표를 찍은 표 1. 그림과 같이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> 그림 부착 단핵 세포의 형광 5. 정량화. 다음 adhE 유전자가 결실<html> 시온 분석은, 커버 글라스에 세포 trypsinised하고 단핵구의 형광 내피 단층의 밀착성의 간접 지표로서, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정 하였다 CellTracker 녹색 미리 라벨링. 진술 일 후 조사에서 이러한 측정의 결과를 얻을 수 위의 그래프에 엮어했다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> 그림 4에서 설명하고 결과는 조사의 십이일 후 10 Gy를 조사, 8~10%을 보여주는 위의 표에 같이 세 가지 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 1 접착제 내피 세포 득점 한 테이블에서 접착 시험 점수의 그림 6. 표현 내피 세포 접착되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; 접착제의 백분율 내피 세포 </td></tr><tr><td></td><td> 디스크 1 </td><td> 디스크 2 </td><td> 디스크 3 </td></tr><tr><td> 필드 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> 필드 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> 필드 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> 이 필드 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> 필드 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> 평균 </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> 표 1. 접착 분석을 기록했다. F에 기술 된 바와 같이 세 개의 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 접착제 내피 세포는 득점했다igure 4 및 결과 십이일 10 Gy를 조사 후, 조사 된 내피 세포를 8-10 %가 접착 된 것을 보여주는 위에서 표로.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K 조회수.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

비디오: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

연구

생물학

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...