이 프로토콜은 기능성 마우스 조혈 줄기 세포의 확장 및 유전자 조작을 허용하여 조혈 줄기 세포 생물학 및 조혈에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다. 이 기술의 장점은 장기간의 생체 외 배양에서 조혈 줄기 세포를 지원하고 유전자 조작을 통해 조혈 유전학을 조사할 수 있다는 것입니다. 이 배양 시스템은 유전, 분자 및 생화학 연구를 포함하여 조혈 줄기 세포 생물학 및 조혈에 대한 다양한 연구를 위한 플랫폼 기술을 제공합니다.
문제 해결 표에는 이 기술에서 발생하는 일반적인 문제에 대한 원인과 해결 방법이 나열되어 있습니다. 골수 세포를 올바르게 추출하고 완전한 배지 변경을 수행하는 방법을 읽는 것보다 훨씬 쉽고 효과적입니다. 조혈모세포(HSC) 추출을 시작하려면 보푸라기가 없는 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 적절하게 안락사된 마우스에서 갓 분리된 뼈를 세척합니다.
약 3 밀리리터의 PBS가 들어있는 박격포에 추가하기 전에 뼈에서 근육과 척수를 제거하십시오. 유봉을 사용하여 뼈를 갈지 않고 부수어 전단력을 최소화합니다. 이어서, 5 밀리리터 주사기에 부착된 19 게이지 바늘을 사용하여, PBS 내로 방출된 큰 골수 단편을 부수고, 현탁액을 70 미크론 필터를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브 내로 옮긴다.
현탁액이 옮겨지면 뼈가 표백 될 때까지 신선한 PBS로 과정을 반복하십시오. 마우스당 약 30밀리리터, 두 마리의 마우스가 더 이상 골수가 보이지 않을 때까지 뼈를 표백하는 경우 50밀리리터의 최종 부피를 목표로 합니다. 마그네틱 컬럼 분리기의 자석에 마그네틱 여과 컬럼을 배치하여 컬럼 농축을 준비하며, 상단에는 50미크론 필터가 있고 아래에는 15밀리리터 원뿔형 튜브가 있습니다.
다음으로, 세포를 알로피코시아닌 항-c-키트 항체 및 알로피코시아닌 자성 마이크로비드로 처리한 후, 50-마이크론 필터 및 여과 컬럼을 통해 멸균 PBS 3밀리리터를 실행한다. PBS가 통과하면, 세포 현탁액을 컬럼을 통해 통과시키고, 이어서 매번 3밀리리터의 차가운 PBS를 3회 세척한다. 각 세척 후 컬럼이 떨어지는 것을 멈출 때까지 기다렸다가 다음 세척을 위해 PBS를 추가합니다.
다음으로, 자석에서 컬럼을 제거하고 새로운 15밀리리터 튜브 위에 놓고 컬럼 플런저를 장착하고 플런저를 밀어 세포를 용출하기 전에 컬럼에 5밀리리터의 차가운 PBS를 컬럼에 추가합니다. 텍스트에 설명된 프로토콜에 따라 원하는 수의 세포 또는 웰에 대해 충분한 HSC 배지를 준비하여 밀리리터당 0.5 내지 100만 개의 세포를 시딩합니다. 그런 다음 c-Kit가 풍부한 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 스핀다운하고 원하는 세포 밀도로 새로 준비된 HSC 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
세포를 피브로넥틴 코팅 또는 음극 표면 대전 플레이트로 옮겨 적절한 부피를 유지합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 조직 배양 인큐베이터에 세포를 넣습니다. 세포 배양을 방해하지 않고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 부드럽게 제거한 후 피펫 또는 진공 펌프를 사용하여 각 웰의 액체 반월판에서 배지의 약 90-95%를 천천히 흡인합니다.
우물 바닥에서 매체를 끌어 올리지 마십시오. 그런 다음 섭씨 37도까지 예열 된 신선한 배지 1 밀리리터를 우물에 넣으십시오. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 실험이 필요할 때까지 2-3일마다 배지를 교체합니다.
뉴클레오펙션 완충액에 세포를 재현탁한 후 즉시 세포 현탁액을 복합 리보핵단백질이 포함된 PCR 튜브로 옮기고 천천히 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 이제 혼합물을 적절한 부피의 전기 천공 큐벳으로 매우 천천히 옮기고 큐벳 내부에 기포가 형성되지 않도록 지속적인 유체 운동을 유지합니다. 그런 다음 전기 천공기에서 전기 천공되는 웰의 위치를 선택합니다.
터치스크린을 이용하여, CD34 긍정 인간으로 세포 유형 프로그램을 선정하고, 맥박 부호 EO100를 입력하고, 그 후에 OK 단추를 누릅니다. 큐벳을 전기 천공기로 옮기고 터치스크린의 시작 버튼을 눌러 전기 천공을 시작합니다. 전기천공 직후, 배양 배지의 반응 부피의 5배를 큐벳에 첨가한다.
이제 세포를 준비된 플레이트로 부드럽게 옮기고 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 다시 놓습니다. 이전에 입증 된 바와 같이 배지 변경을 수행 한 후 10 마이크로 리터의 세포를 수집하고 Turk의 용액을 사용하여 혈구 분석기로 1 : 2로 희석하여 계산합니다. 형질도입을 위해 필요한 용량의 세포를 피브로넥틴-코팅된 플레이트에 다시 플레이트하고, 별도로, 형질도입되지 않은 음성 대조군 세포를 플레이트에 넣는다.
그런 다음 렌티바이러스 벡터를 세포가 포함된 각 웰에 첨가하여 세포당 20개의 형질도입 단위의 용량을 유지하여 약 30%의 형질도입 효율을 달성합니다. 그러나, 렌티바이러스 벡터 용량은 실험 요건에 따라 경험적으로 결정한다. 마지막으로, 세포를 조직 배양 배양기에 6시간 동안 되돌립니다.
앞에서 설명한 대로 매체 변경을 수행합니다. c-Kit-농축 HSC의 형광 활성화 세포 분류는 CD150 양성, CD34 음성, c-Kit 양성, Sca1 양성 및 계통 음성인 세포의 약 0.2%를 산출했습니다. HSPC 배양 4주 후, CD201 양성, CD150 양성, c-Kit 양성, Sca1 양성 및 계통 음성 분획은 약 10%GFP-발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후, GFP-양성 세포는 약 30%합류할 때 배양의 예상 밀도는 밀리리터당 약 200만 세포였습니다.
약 50%의 세포 사멸이 첫 번째 배지 변경이 수행되기 전 처음 24 내지 48시간 이내에 관찰되었다. 그러나 일주일 후, 세포 수는 시드 된 세포 수의 80-100 %로 돌아 왔습니다. 신선하고 예열된 배지를 사용한 정확한 배지 교환은 이 HSC 배양 방법의 장기적인 안정성에 매우 중요합니다.
2019년 오리지널 방법이 발표된 이후 이 분야에서는 HSC 생물학을 연구하기 위해 다양한 방식으로 사용하기 시작했습니다.
