Name: neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.

모든 마우스 실험은 미국 동물 복지 법에 따라 수행하고 미네소타 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마우스 심장 격리 1. 방법 <ol><li> 단일 사용 블레이드 잘린에 의해 신생아 마우스를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 흉부를 면봉. </li><li> # 5 포셉 한 쌍의 측 방향으로 피부를 당기면서 표준 가위로 가슴 벽에서 멀리 절단하여 가슴에서 피부를 해부하다. </li><li> 복벽을 통해 절단에 의해 가위로 흉골 단지 열등한 복부를 관통. 가위로 가슴의 양쪽에 리브 불구하고 절단하는 동안 # 5 집게와 칼 모양의 프로세스를 파악, 몸에서 rostrally 흉골을 철회. 흉곽은 심장을 표시 할 수있는 집게와 우량 반영됩니다. </li><li> 퉁명스럽게 노출, # 5 집게 측 방향으로 당겨 흉선의 두 가지 주요 로브를 해부대동맥 아치뿐만 아니라 대정맥과 폐정맥. </li><li> 10 센티미터 봄 가위로 대동맥 궁에서 주요 동맥 및 대동맥 자체를 가로로 쪼개다. 마음의베이스와 팔 머리 동맥과 대동맥을 유지합니다. 기도와 식도에서 분리, 앞으로 마음을 반영하기 위해 #와 함께 5 집게를 절단 혈관의 끝을 잡고. </li><li> 10 센티미터 봄 가위로 심장의 양쪽 폐와 심장 사이에서 절단하여, 폐 혈관 및 기타 주요 정맥을 가로로 쪼개다. 혈관은 배수를 제공 할 열려. </li><li> 주요 혈관의 잘린 끝을 잡고는 # 5 집게와 종격동에서 마음을 제거합니다. 카테터 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 60mm 배양 접시에 마음을 놓습니다. </li></ol> 랑겐 돌프 관류에 의해 탈세 포화 2. 방법 <ol><li> 사전에 카테터 어셈블리를 준비합니다. 4 센티미터 부분을 그립니다PE의 작은 알코올 불꽃 50 튜브는 작은, 얇은 카테터를 만들 수 있습니다. 측정 기준을 만족하는 날개 끝 손질 (약. 약. 500 μm의 지름의 플랜지 300 μm의 외경 OD)도 1에 도시 된이.이 손잡이의 각각의 측면에서 두 개의 대칭적인 카테터를 제공한다. </li><li> 얇은 끝 부분에있는 구멍에 플랜지를 용융, 간단히 불꽃에 튜브의 절단 끝을 가리 킵니다. </li><li> PBS로 12 mL를 주사기를 채우고 주사기에 3 방향 스톱 콕을 배치하여 카테터를 조립한다. 꼭지에 22 G × 1 바늘을 추가하고 격막을 통해 바늘을 구동한다. 바늘 (그림. 1)에 그려진 PE 튜브 카테터를 밀어 넣습니다. </li><li> 모든 기포가 제거 된 것을 보장 PBS로 조립 부품 관개. </li><li> 대동맥 밸브를지나 연장하지, 분리 된 심장의 대동맥으로, 위의 설명과 7-0 봉합사의 한 넥타이와 결찰로 제조 된 카테터를 삽입합니다. t의 플랜지를 휴식그는 꽉 밀봉을하고 카테터를 오는 마음을 방지 넥타이에 근위 카테터. </li><li> 부드럽게 PBS가 들어있는 주사기를 사용하여 마음을 관류하면서, 배율 아래 카테터를 관찰한다. 거기에 누수가 시스템에없고 잠재 혈액이 제거 될 때 조직이 균일 blanches 있는지 확인합니다. </li><li> 입구 어댑터의 목에 격벽을두고 유리 위에 측면 폴딩하여 밀봉. </li><li> 도 20에 나타낸 바와 같이 mmHg의 압력을 발생하는 열을 생성하기 위해 충분한 길이의 선을 통하여 증류수 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 60 ㎖ (DH 2 O)로 충전 된 저장조에 부착. 1. 1 mmHg에서의 관계에 기초하여 상기 액체 컬럼의 높이의 압력을 계산하면 1.3595 cm의 H 2 O. 같다 주의 : SDS는 자극 특성을 가진 고도의 응집 분말이다. 접촉은 피해야한다. 적절한 보호 복을 사용하여 분말을 처리합니다. </li><li> 14 시간 동안 1 % SDS와 마음을 관류. 마음은 전혀 관찰 나머지 조직과 외관 반투명됩니다. </li><li> 나머지 SDS 용액의 콕하도록 시스템을 씻어 내고 10 ㎖의 DH 2 O로 대체 1X 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균)를 포함하는 60 ml의 PBS 다음 10 ml의 DH 2 O 다음 (증류수에 희석) 10 ml의 1 % 트리톤 X-100과 마음을, 관류. </li><li> 4 ° C에서 1 배 펜 연쇄상 구균와 PBS의 마음을 저장합니다. 의도 된 게시물 탈세 포화 응용 프로그램이 다음 대동맥의 카테터가 유지되어야한다 관류를 필요로하는 경우, 그렇지 않으면 봉합 넥타이를 잘라 카테터를 제거합니다. </li></ol> 3. DNA 결정 <ol><li> 50 mM의 KCl을 200 μg의 / ㎖ 프로 테 K를 사용하여 decellularized ECM 또는 제어 마음의 다이제스트를 준비, 2.5 밀리미터의 MgCl 10 mM 트리스 (산도 8.3) 2, 0.45 % 트윈 20. </li><li> 조직이 용해 될 때까지 교반하면서 55 ℃에서 조직을 부화일반적으로 4 ~ 5 시간. </li><li> 분석 4,11 바인딩 DNA와 균질의 DNA 함량을 정량. </li></ol> 4. 고정 및 조직의 단면 <ol><li> 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 decellularized, recellularized 또는 제어 P3의 마음을 수정합니다. </li><li> PBS 배에서 조직을 씻으십시오. </li><li> 이 싱크 될 때까지 4 ℃에서 0.1 M 인산 완충액 7.5 % 자당 용액의 조직을 놓는다. </li><li> 이 싱크 때까지, 다시 4 ° C에서 0.1 M 인산 버퍼에 15 % 자당의 해결책을 변경합니다. </li><li> 37 ° C로 가온 조직을 15 % 수 크로스 및 0.1 M 인산염 완충액 젤라틴 용액 부피의 절반을 교체하고 밤새 평형. 젤라틴의 농도는 1 %, 2.5 %, 5 %를 단계적으로 증가하고 마지막으로 7.5 %를 두 번 있습니다. </li><li> 신선한 7.5 % 젤라틴을 사용 cryomolds에서 샘플을 놓습니다. decellularized 샘플의 형상을 회복하기 위해 액체 젤라틴 t로서 챔버로 살포 될 수있다그는 마음이 성형. 액체 질소에 cryomolds 부동으로 고정. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 그라 이오 스탯으로 잘라 (10 μm의 두께) 섹션. 섹션면에 가까운 슬라이드를 가져오고 섹션 인해 정전 기적으로 처리 된 슬라이드의 전하로 표면에 칼으로부터 이동 관찰합니다. 밤새 슬라이드를 건조 및 향후 분석을 위해 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 평형 후 젤라틴을 용해 37 ° C에서 20 분 동안 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 넣습니다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신와 단계 4.7에서 절단 된 부분을 얼룩. 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드. 1.5 분 동안 에이전트 블루 우잉, 1 분 동안 수돗물, 3 분 동안 버퍼, 1.5 분 동안 수돗물, 45 초 동안 헤 마톡 실린에 단계 4.8에서 수화 슬라이드를 노출, 80 % 에탄올 1 분, 알코올 에오신 Y 8 초, 1 분 배 1 분, 1 분 배 100 % 에탄올, 에이전트를 삭제 (크실렌 대체) 80 % 에탄올, 수지와 커버 슬립기반 장착 매체. 현미경 슬라이드를 검사합니다. </li><li> 가습 실에서 수화 슬라이드를 배치하여 이러한 콜라겐 IV와 같은 ECM 구조 단백질의 심장 ECM, 얼룩의 ECM 단백질의 반응성의 보존을 확인하고 0.1 % 트리톤과 인산염 완충 식염수에 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)로 처리하려면 -X100 실온에서 1 시간 (RT)에 대한 (PBST). 조직 섹션을 충당하기에 충분한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 5 % NDS / PBST에서 경험적으로 결정된 희석 선택의 차 항체와 솔루션을 교체합니다. 예를 들어, 콜라겐 IV 항체를 1로 희석 하였다 : 150. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> PBST 배와 슬라이드를 세척하고 형광 염료와 결합 선택의 차 항체를 적용합니다. 실험적으로 결정된 양으로 항체를 희석. 실온에서 1 시간 동안 품어. PBS 3 배 씻으시오. </li><li> DAPI는 DAPI 함유 mounti를 사용하여 세포 핵의 유무를 확인하는 등의 DNA 결합 염료 슬라이드 얼룩커버 슬라이드를 미끄러 때 매체 ng를. </li><li> 400X 50에서 형광 현미경 슬라이드를 검사합니다. </li></ol> Recellularization 5. P1 신생아 쥐 심실 심근 <ol><li> 70 % 에탄올로 각각의 강아지 스프레이 단일 사용 블레이드 목을 베다. </li><li> 흉부가 흉강을 노출 작은 멸균 가위로 중간 선에서 분할되는 동안 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 각각의 강아지를 잡으십시오. 이 주요 혈관 만 심실 조직을 떠나는 심방의 무료 절단하는 동안 심장이 가슴에서 자유롭게 돌출 할 수 있도록 압력을 적용합니다. </li><li> 20 mL의 빙냉 칼슘 모든 하트가 수집 될 때까지 20 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (CBFHH)과 중탄산염 무료 행크 완충 식염수 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 직접 각각의 심장 놓는다. </li><li> CBFHH을 기음과 튜브에 신선한 CBFHH (얼음처럼 차가운)의 10 ~ 15 ml에 추가 할 수 있습니다. t의 조직을 소용돌이에 의해 조직을 씻으십시오그는 튜브를 여러 번. </li><li> 60 밀리미터 플라스틱 페트리 접시에 마음을 함유하는 용액을 가만히 따르다. </li><li> 멀리 봄 가위로 마음에서 그것을 트리밍에 의해 얼음에 확대에 따라 마음에서 어떤 잠재적 인 심방 조직을 해부하다. 균일 크기의 작은 조각으로 심실을 말하다. # 5 집게로 요리에서 어떤 구분이 아닌 심실 조직을 제거합니다. </li><li> 멸균 마이크로 교반 막대를 포함하는 작은 멸균 바이알에 조직 조각을 전송할 필요로 CBFHH 용액 많은 피펫. </li><li> 조직은 유리 병의 바닥에 침전하고 CBFHH 솔루션을 제거 할 수 있습니다. </li><li> CBFHH의 효소 용액 1.75 ㎎ / ㎖ 트립신, 20 μg의 / ㎖의 DNase II 50 ㎖를 확인합니다. 피펫 (5)이 효소 용액 mL 및 자기 교반기 다진 심실 조직과 장소를 함유하는 관에 추가. 8 분 동안 실온에서 일정한 속도 (340 RPM)에서 교반 하였다. 참고 : 교반 작용이 완만하고 아직 허용해야슬러리의 서스펜션. </li><li> 스터 판에서 병을 제거하고 슬러리를 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 그것은 주로 혈액 세포 및 조직 파편을 포함로 피펫은, 초기 소화 상층 액을 버리고. </li><li> 피펫 제 5 ㎖의 효소 용액의 분취 량과 소화 뇌실에 추가. 8 분 동안 교반하고 또 다른 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이전 다이제스트를 시작으로, 두 개의 50 ㎖ 튜브 (1 표지 및 2) 각각의 제조 12 ml를 함유하는 빙냉 소 태아 혈청 (FBS). 각 튜브 꼭대기 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 피펫 관 (1)의 필터를 통해이 뜨는. </li><li> FBS가 포함 된 두 개의 튜브의 다이제스트 상등액의 위치를 ​​교대로 소화 공정을 추가로 8 회 반복한다. 각각의 튜브에서 동일한 양을 보장하기 위해 관 (1)과 (2) 사이에 균등 최종 상등액을 분할. 참고 : 각 컬렉션 튜브는 현재 세포 현탁액의 32.5 ml의 총 부피를 포함합니다. </li><li> 튜브가 포함 된 원심 분리기4 ° C에서 6 분의 상층 액 150 XG를 보내고. </li><li> 소화 씩을 수집하는 동안, 접시 당 (10 % FBS, 1X 펜 연쇄상 구균, 1 배 L 글루타민과 둘 베코의 변형 이글의 미디어 (DMEM)) 미디어의 6 ㎖로 오 100mm의 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 미디어를 평형 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 이러한 분취 량을 품어. </li><li> 모두 수집 튜브에서 세포 결합 된 CBFHH 효소 혼합물 대기음 상기 제조 배양 배지의 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 100 밀리 판의 각 세포 현탁액의 6 mL로 돌아가서 37 ° C에서 45 분 동안 품어. </li><li> (섬유 아세포 분획 접시에 접착하기 시작하고, 원하는 경우 별도로 성장 될 수있다) 인큐베이션의 끝에, 5 새로운 요리에 비 부착 세포를 전송하고 45 분 동안 다시 배양한다. </li><li> 프리 도금의 두 번째 라운드의 끝에서, 요리의 미디어 및 비 - 부착 세포를 수집하고 (150)에 미디어를 스핀6 분 XG. </li><li> (관류 액 100 ㎕의 구조 당 4.0 × 10 5 세포)를 대략 원하는 농도로 세포를 가지고 초과 용지를 그립니다. 계산 및 또는 생존 능력 테스트 (14)에 대한 나누어지는을 제거합니다. </li></ol> P3 심장 매트릭스 6. 생물 반응기 Recellularization <ol><li> 밤새 세포를 첨가하기 전에 배지 (단계 5.15 참조)와 격리 심장 매트릭스를 전처리. </li><li> 도에 나타내는 바와 같이 랑겐 돌프 시스템의 요소들을 조립한다. 이. 유리 부를 오토 클레이브 산화 에틸렌 멸균을 보증하기 위해 플라스틱 부품 살균. 시스템의 다양한 서브 유닛이 지지대 상에 장착되기 전에 층류 후드에서 조립 될 수있다. 순환 수조 가열 수류는 명확성을 위해 생략되었다. </li><li> 조직 배양 배지 120 ml에 함께 조립 된 시스템을 작성한다 (단계 5.15 참조). </li><li> 60 밀리미터 막 다른의 단계 2.14에서 카테터 심장 매트릭스를 배치배율 아래 진짜야 요리 카테터에 단계 5.20에서 세포 현탁액로드 × 1 바늘 22 G와 1 ML의 주사기를 연결합니다. 이 어셈블리는 마음을 embolizing 피하기 위해 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 통한 관상 동맥 심장 행렬에 세포 현탁액 100 μl를 관류. 완료되면, 주사기 / 바늘 조합을 분리합니다. 참고 : 약의 느린 관류. 분당 20 μL가 심장 천이, 정맥 유출 셀을 방지 할 필요가있다. </li><li> 생물 반응기 심장 병 뚜껑의 아래쪽에있는 루어 피팅에 고정 된 22g 무딘 스텁으로, 그루터기에 카테터를 밀어 넣습니다. </li><li> 연동 펌프를 시작하고 그림 2에 설명 된대로 진행하는 것이 관찰한다. 저수지에서 흐름의 진행 단계 2.5에서 대동맥에 배치 카테터 (그림. 2에서 빨간색 경로)에 버블 트랩을 통해 펌프를 통해. 정맥에서 심장 순환 흐름을 관찰미디어 저장소에 정점, 재순환에서 s와 똑. 주 : 관류 유량 같은 구조의 혈관 저항 및 심장의 크기이지만 100 μL 내지 50의 비율로 각각의 요인에 의존 / 분 좋은 출발점이다. 중간 시점에서, 관능 평가가 수행 될 수있다. 신생아 recellularized 심장의 크기 규모는 수행 할 수 있지만, 우리는 광학 기반 시스템 그들이 성인 쥐 마음에 사용 된 것처럼 동작을 치고 정량화하는 데 사용할 수있는 것으로 확인의 평가를 제한한다. 4 구조는 확장을 위해 관류 할 수 있습니다 (23 시간까지) 시간의 기간. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또?...

심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다. 포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 성 흉터의 부족, 신생 혈관의 형성, 심장 외막에서 혈관 신생 인자의 방출 및 심근 확산 5-8 특징 11. 시간이 회생 창이 bioartificial 심장의 개발을위한 신규 물질의 공급원으로 신생아 심장을 사용하는 가능성을 제공한다. 세포 외 기질은 cardiomyocyt를 촉진하는 중요한 단서를 제공하는 것으로 알려져E 증식 및 성장. 신생아 및 성인 행렬 (12) 및 재생을 촉진 할 수있는 능력 분자의 가용성에 뚜렷한 차이가 13을 탐구하고있다. Decellularized 성인 매트릭스 셀룰러 다시 채우기위한 ECM 지지체 및 bioartificial 심장의 생성을 제공하는 여러 연구에 사용되었다. 줄기 세포 기술이 연구 및 새로운 발견이 빠르게 발전하고 있지만, 몇 가지 장애물이 충족되어야 아직. 예를 들어, 매트릭스 벽으로 행렬의 기본 구조 셀룰러 통합 보존 한계 및 능력이 접근법의 성공 증식 및 성장은 모든 제한을 지원한다. 회생 특성이 우수 신생아 심장 기인되었지만, 이러한 조직을 사용하는 실용적인 측면은 탐색을 제한하고있다. 신생아 심장의 증명 재생 능력을 바탕으로, 우리는 개발을 통해 새로운 매트릭스를 개발했다P3 마우스 심장 탈세 포화의 기술. 이전에 6 결정하지만 마음 수확, decellularize 및 recellularize에 충분한 크기로는 심장 재생의 창 내에서 그대로 P3의 마음은이 연구를 위해 선택되었다. 이 연구의 목적은 쥐 신생아 심장에서 매트릭스를 생성하는 가능성을 입증한다. 우리의 연구는 ECM의 단백질 구조적 무결성을 유지하면서 분 신생아 심장 decellularizing의 가능성에 대한 증거를 제공한다. 우리는 또한 mCherry 표현 심근이 심장 ECM을 recellularize 할 수있는 능력을 보여 우리는 recellularization 다음과 같은 다양한 심장 마커의 발현이 심근을 조사했다. 이 기술은 bioartificial 심장의 개발 신생아 행렬의 우월성 시험을 허용한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. Materials for mouse heart isolation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>60 mm Culture dish</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Single Use Blade</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Standard Scissors</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Spring Scissors 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Materials for decellularization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Inlet adaptor</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Male luer to 1/8&quot; hose barb adaptor</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Female luer to 1/8&quot; hose barb adaptor</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 surgical suture&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Clamp regular holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>60 cc syringe barrel&amp;nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>22 G x 1 Syringe Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>12 cc syringe</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>3-way stop cock</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>PE50 tubing</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Must be formable by heat. Polyethylene recommended.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>Or MilliQ system purified water.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>or equivalent&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Materials for DNA quantitation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>&gt;30 U/mg activity</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Tris base/hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA assay kit</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>requires fluorimeter to read</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Method for fixation and sectioning of tissue&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Gelatin Type A from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>must be 300 bloom or greater</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. Method for tissue histology&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Microscope Slides&amp;nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801570</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3803590</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Blue buffer&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3802915</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Alcoholic Eosin Y 515&amp;nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&amp;nbsp;</td><td>3801615</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Formula 83 Xylene substitute&amp;nbsp;</td><td>CBG Biotech&amp;nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Collagen IV Antibody</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Actinin Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>mCherry Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>NKX2.5 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse AF488 Antibody</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken AF594 Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&amp;nbsp;</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat CY5 Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm plates</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco&#039;s Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Vitamin B12&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fibronectin coated plates&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Heart bioreactor glassware</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>Must be sterilizable by autoclaving or gas.</td></tr></tbody></table>

neonatal cardiac scaffolds: novel matrices for regenerative studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

탈세 포화 평균적으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 P3 심장 탈세 포화까지의 시간은 약 14 시간이다. P3의 신생아 23 mg의 평균 심장 무게 주어진. Acellularity 도 3a는 완전히 그대로 P3 신생아 마음을 (전체 마운트). 그림 3b는. 탈세 포화 다음과 같은 마음을 보여줍니다도 4a 및...

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Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K 조회수.  University of Minnesota.  이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다. 

비디오: Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

연구

생체공학

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

생물학

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and ...

내피에서 중간엽으로의 전환을 연구하기 위한 생체 내 심장 이식

A Neonatal Heterotopic Rat Heart Transplantation Model for the Study of Endothelial-to-Mesenchymal Transition

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and precludes patients with congenital critical aortic stenosis and hypoplastic left heart syndrome (HLHS) from curative anatomical biventricular surgical repair. Surgical resection is currently the only available therapeutic option, but EFE often recurs, sometimes with an even more infiltrative growth pattern into the adjacent myocardium.
To better understand the underlying mechanisms of EFE and to explore therapeutic strategies, an animal model suitable for preclinical testing was developed. The animal model takes into consideration that EFE is a disease of the immature heart and is associated with flow disturbances, as supported by clinical observations. Thus, the heterotopic heart transplantation of neonatal rat donor hearts is the basis for this model.
A neonatal rat heart is transplanted into an adolescent rat&#39;s abdomen and connected to the recipient&#39;s infrarenal aorta and inferior vena cava. While perfusion of the coronary arteries preserves the viability of the donor heart, flow stagnation within the LV induces EFE growth in the very immature heart. The underlying mechanism of EFE formation is the transition of endocardial endothelial cells to mesenchymal cells (EndMT), which is a well-described mechanism of early embryonic development of the valves and septa but also the leading cause of fibrosis in heart failure. EFE formation can be macroscopically observed within days after transplantation. Transabdominal echocardiography is used to monitor the graft viability, contractility, and the patency of the anastomoses. Following euthanasia, the EFE tissue is harvested, and it shows the same histopathological characteristics as human EFE tissue from HLHS patients.
This in vivo model allows for studying the mechanisms of EFE development in the heart and testing treatment options to prevent this pathological tissue formation and provides the opportunity for a more generalized examination of EndMT-induced fibrosis.

저자 스포트라이트: 내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델  

This work presents an animal model of endothelial-to-mesenchymal transition-induced fibrosis, as seen in congenital cardiac defects such as critical aortic stenosis or hypoplastic left heart syndrome, which allows for detailed histological tissue evaluation, the identification of regulatory signaling pathways, and the testing of treatment options.

내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and ...