생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

이 프로토콜은 인간 유도 된 신체 부위및 STEM 세포 유래 심장 세포에서 파생 된 메쉬 모양의 엔지니어링 심장 조직을 만드는 고귀하고 쉬운 방법을 설명합니다. 조직 기하학의 유연성과 보존 된 조직 기능의 확장성은이 기술의 주요 장점입니다. 이식된 메쉬 형상 ECT는 쥐 심근 경색 모델에서 심장 구조와 기능을 복원할 수 있습니다.

심장 재생 치료에 사용하기위한 타당성을 확인. 이러한 기술은 일관된 결과를 위해 재현 가능한 인간 STEM 세포 처리 및 조직 배양 기술을 요구합니다. 경화 PDMS 시트를 적절한 크기로 절단하여 시트를 실리콘 접착제로 결합하여 21 by 20.5mm 직사각형 트레이를 7밀리미터 너비의 20.5mm 직사각형 트레이와 비틀거리는 위치에서 2.5밀리미터 높이의 직사각형 기둥을 제작할 수 있도록 합니다.

두 줄의 게시물 사이의 수평 간격은 2.5 밀리미터여야 합니다. 1시간 동안 PBS에서 1%폴로사머 407로 금형을 코팅하기 전에 20분 동안 트레이를 섭씨 120도에서 자동 클럭입니다. 그런 다음 PBS로 금형을 철저히 헹구고 금형을 6웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다.

계보 분석을 위해 심근세포와 내피 및 혈관 벽화 세포 프로토콜의 세포를 결합합니다. 벽화 세포의 최종 농도가 10~20%로 총 세포수에서 6배 10~6개의 세포가 구성될 수 있도록 한다. 133 마이크로리터의 산 수용성 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1용액과 알칼리 버퍼 17마이크로리터를 얼음 위에 10배 최소 필수 매체17마이크로리터에 혼합합니다.

그런 다음 콜라겐 용액에 지하 멤브레인 매트릭스 67 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 세포를 원심분리하고 태아 소 혈청과 항생제로 보충된 고혈당 덜벡코의 최소 필수 매체의 167마이크로리터에서 펠릿을 재중단합니다. 매트릭스 용액의 셀을 얼음에 섞습니다.

그런 다음 400 마이크로리터의 셀 매트릭스 서스펜션을 폴로사머 407 코팅 PDMS 조직 금형에 조심스럽게 부어 줍니다. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 세포 매트릭스 혼합물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 60분 동안 배양한다. 조직이 형성되면, ECT 배양 배지의 4 밀리리터로 금형을 조심스럽게 흡수하고 14 일 동안 세포 배양 배양 배양소로 플레이트를 반환합니다.

ECT 이식 전에 미세 포셉을 살균하여 로딩 게시물에서 ECT를 조심스럽게 제거합니다. 조직 금형은 다양한 패턴, 포스트 길이 및 포스트 간격으로 제작되어 서로 다른 최종 ECT 형상을 생성할 수 있습니다. 이 분석을 위해 폭 이 2.5mm의 7밀리미터 길이의 금형이 사용되었습니다.

Poloxamer 407은 금형에 대한 세포의 접착을 방지하고 14 일 만에 빠른 겔 다짐에 따라 특성 메쉬 구조의 형성을 가능하게합니다. 구조는 ECT가 금형에서 방출된 후에도 유지됩니다. 제조 된 조직 구조는 약 1.5 센티미터 폭과 0.5 밀리미터 두께입니다.

그리고 메쉬의 각 번들의 폭은 평균 약 0.5 밀리미터입니다. 동일한 비틀거림 포스트 설계를 가진 4배 더 큰 금형으로부터 2,400만 개의 셀을 함유한 3센티미터 최종 폭 메쉬 ECT를 생성할 수 있다. 이 더 큰 메쉬 ECT는 금형에서 쉽게 제거할 수 있으며 더 작은 메시 ECT에 해당하는 로컬 힘 행위를 생성합니다.

최종 겔의 결함감을 방지하기 위해 기포를 생성하지 않고 조직 몰드에 세포 매트릭스 혼합물을 고르게 붓는 것이 중요하다. 계약자의 기능적 특성화. 내장 된 시스템을 사용하여 네 번째 주파수 관계를 수행 할 수 있습니다.

우리의 궁극적인 목표는 대규모 동물 전임상 연구를 활용하는 임상 치료법으로 ECT 패러다임을 번역하는 것입니다.