이 방법은 연골 재생에 사용될 수 있는 네이티브 조직에서 파생된 스캐폴드를 만드는 방법을 제시한다. 이 기술의 주요 장점은 기본 연골의 구성 요소가 시험관 내 및 생체 내에서 연골 형성 및 재생을 촉진 할 수있는 스캐폴드에 보존된다는 것입니다. 이러한 방법은 말의 연골을 사용하여 관절을 억누르지만 다른 관절의 연골도 사용할 수 있습니다.
시작하려면, 연골 격리를 위한 손상되지 않은 카다브릭 관절을 얻고 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피부 과잉 지방 및 근육 조직을 제거한다. 다음으로, 조인트의 확장 변곡점을 수행하여 관절이 관절이 명료하는 위치를 정의한다. 조인트 캐비티에 도달하기 위해 수평 절개를 합니다.
다음으로, 관절 영역을 열어 수직 절개를합니다. 관절 구멍은 올바른 절개를 수행 할 때 공동에서 떨어지는 가능성이 활액으로 채워집니다. 과도한 지방, 근육 및 힘줄을 제거하고 관절을 함께 유지하는 힘줄을 절단하여 관절을 완전히 열어 보십시오.
연골을 주의 깊게 검사하여 거시적 손상이 있는지 검사합니다. 관절 연골이 광택이 매끄러운 외관을 가지고 있지 않거나 증거, 물집, 갈라진 또는 결함이 있는 경우 연골을 버리고 다시 시작합니다. 멸균 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 제거하십시오.
깊은 영역 연골을 제거하기 위해 아전드랄 뼈까지 모든 방법을 잘라. 이전에 준비된 연골 세척 용액을 포함하는 50 밀리리터 튜브에서 제거된 연골 조각을 수집합니다. 가공 하는 동안, 정기적으로 연골에 연골 세척 용액을 드립 연골 건조에서 연골을 방지 합니다.
관심있는 모든 영역에서 연골을 수집 한 후, 5 분 동안 액체 질소에 연골 조각을 동결 스냅. 그런 다음 연골 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 냉동 된 조각을 동결 건조기에 즉시 놓습니다. 동결 건조기와 함께 24 시간 동안 연골 조각을 lyophilize합니다.
완료되면, 실온에서 건조 한 장소에 동결 말린 연골 조각을 저장합니다. 수동 처리를 위해 박격포를 미리 식히고 액체 질소로 유봉한 다음 lyophilized 연골 조각을 박격포에 넣고 침수하고 액체 질소를 담급니다. 샘플을 충분히 분쇄 할 때까지 약 45 분 동안 손으로 직접 분쇄합니다.
또는 밀링 기계를 사용하여 자동으로 샘플을 분쇄하려면 액체 질소를 추가하여 밀링 기계의 연삭 구획을 미리 냉각하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 lyophilized 연골 조각을 추가하고 최대 1 분 동안 몇 초 동안 미리 설정된 속도로 샘플을 밀링합니다. 모든 파티클이 접지되고 파티클이 연삭 구획의 맨 아래에 남아 있지 않도록 하십시오.
마지막으로, 스캐폴드를 형성하기 전에 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 탈세포화 기법과 함께 따르십시오. 작은 라벨이 있는 연골 입자를 원통형 플라스틱 금형으로 옮기습니다. 모든 기포를 눌러 비계의 구멍을 피하고 금형을 완전히 채웁니다.
스캐폴드S의 충치를 피하려면 금형을 연골 입자로 채우는 동안 기포를 압착해야 합니다. 형성 후 영하 20도에서 10 분 동안 금형을 동결하십시오. 그런 다음 동결 건조기에서 24 시간 동안 금형 내의 연골 비계를 lyophilize합니다.
lyophilization 후, 조심스럽게 금형에서 비계를 제거합니다. 365 나노미터 파장 UV 빛 아래에 스캐폴드를 놓고 하룻밤 사이에 교차 연결합니다. 멸균 된 비계를 3 밀리미터 두께의 조각으로 절단하여 스캐폴드 디스크를 형성합니다.
그런 다음 비계를 6 개의 우물 판의 별도의 우물로 옮기. 스캐폴드 위에 1밀리리터의 콘드로사이클 확장 매체를 추가하고 30분 동안 수분을 보충할 수 있습니다. 비계가 재수화되는 동안, 미리 담근 비계 위에 준비된 세포 현탁액의 세포 및 파이펫 50 마이크로리터를 준비한다.
그런 다음 37 °C에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오. 연골세포를 사용할 때, 분화된 세포의 수를 최소화하기 위해 첫 번째 통로를 지나 확장되지 않았는지 확인하십시오. 1 시간 후, 문화 후드에 접시를 반환하고 조심스럽게 비계를 뒤집어.
스캐폴드에 남은 50마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫하고 섭씨 37도에서 또 다른 시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 비계로 우물에 3 밀리리터의 매체를 추가합니다. 비계에 직접 배지를 파이프하지 말고 세포의 분리를 피하기 위해 배양 판을 부드럽게 처리하십시오.
플레이트를 인큐베이터와 배양 세포에 섭씨 37도에서 양보한 비계에 반품한다. 조직학적 염색과 DNA 정량화의 조합은 이 문서에서 제시된 방법이 충분한 연골 비계 탈세포화를 초래한다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 결과 발판은 DNA의 탐지할 수 없는 수준과 더불어 어떤 세포도 포함하는 것을 찾아냈습니다.
그(것)들은 또한 글리코아미노글리칸이 부족하고 콜라겐 II.Here가 풍부합니다, 네오 매트릭스 형성은 4 주 동안 배양된 중간엽 줄기 세포로 양보된 비계에서 관찰됩니다. 글리코아미노글리칸의 형성은 4주 후에 풍부합니다. 이 절차를 시도한 후 모든 응용 프로그램에서 사용하기 전에 탈세포화가 성공했는지 여부를 검사하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 서양 블롯 분석기 와 같은 추가 생화확적인 분석은 성장 인자와 같은 그밖 분대의 존재에 관하여 특정 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 조직 공학 분야의 연구원들이 동종 및 합성 소스에서 탈세포 조직을 사용하여 연골 재생 전략을 탐구하는 길을 열었습니다. 실험실 코트와 장갑착용 등의 예방 조치는 항상 취해야 합니다.
