Name: methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
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노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.

1. 제한 효소 처리
<ol><li>총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화. 참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다.</li>
	<li>각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물</li>
	<li>4 h 37 ° c.에 대 한 열 cycler에 있는 장소 관</li>
</ol>2. 황산 변환
<ol><li>BamHI 치료 DNA 나트륨 황산29설명 되어 있는 대로 사용 하 여 변환 합니다.</li>
	<li>200-500 ng BamHI 치료 DNA를 사용 하 여 각 변환 반응 20 μ의 전체 볼륨에 대 한. DNA 복구 50-70%입니다.</li>
	<li>황산 변환 DNA 10 μ 차입 버퍼에 elute</li>
	<li>Fluorometry에 의해 단일 가닥 DNA를 계량.</li>
	<li>선택 사항: 프로토콜의 나머지를 진행 하기 전에-20 ° C에서의 황산 변환 DNA를 저장 합니다. 장기 저장을 위한 저장-80 ° C에서의 황산 변환 DNA</li>
</ol>3입니다. 뇌관을 시퀀싱 하는 황산의 디자인
<ol><li>황산 시퀀싱 온라인 도구 Methprimer30 BiSearch31,32를 사용 하 여 뇌관 디자인. 참고: Methprimer 및 BiSearch 수 뇌관 바인딩 시퀀스 게놈 시퀀스에 대 한 검색 cytosines thymines 후 황산 처리와 유사 하 게 변환 됩니다.</li>
	<li>최적의 고 공평한 확대를 위한 뇌관에서 CpG 디를 방지 하 고 100-300 bp 사이 amplicon 크기를 디자인 합니다.</li>
	<li>설계 된 뇌관 뇌관 검색BiSearch의 함수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 DNA에 특정 인지 확인 합니다. 이미 설계 된 황산 변환 뇌관 삽입, 황산 상자 똑 딱 거리 고 PCR 매개 변수 및 참조 게놈을 포함. 참고: 가능한 PCR 제품의 목록이 표시 됩니다.</li>
	<li>복사 가기 1-5 뇌관 시퀀스 하 그들 oligonucleotide 종합에 대 한 주문 양식으로. 참고: 목록 인간 실험실에서 검증 된 마우스 mtDNA 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>황산을 사용 하 여 테스트 뇌관 PCR agarose 젤 전기 이동 법 4 단계에 설명 된 대로 다음 변환. 테스트와 별도로 모든 뇌관 쌍을 최적화 하 고 정확한 amplicon 크기 agarose 젤에 표시. 참고: 멀티플렉싱 뇌관, 필요한 경우 추가 하나에 여러 개의 뇌관 PCR 반응 단일 agarose 젤 전기 이동 법 또는, polyacrylamide 젤 전기 이동 법, 비슷한 제품을 구별 하는 것 같은 더 resolutive 방법에 PCR 제품을 시각화 크기입니다.</li>
</ol>4. 황산 PCR 및 젤 추출 변환
<ol><li>관심 영역을 증폭, 뜨거운 시작 Taq 중 합 효소를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 믹스 100 ng DNA, 500 µ M와 반대로 감각 뇌관, 1 µ L dNTP 믹스 (각 dNTP의 10 µ M), 그리고 50 µ L. 총 볼륨에 7.5 U/반응에서 중 합 효소를 변환 하는 간단히, 다음과 같은 조건 가진 PCR 실행: 95 ° C에서 5 분 (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 별도로 프라이 머를 사용 하거나 다중화.</li>
	<li>선택 사항: 뇌관, 멀티플렉싱 사용 200 ng 변환 DNA와 자전거 다음과: 5 분 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 참고: 온도 뇌관의 녹는 온도 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>2 %agarose 100 볼트에 전기 이동 법 젤에 PCR 제품 주제.</li>
	<li>부드러운 자외선에서 메스와 PCR 제품을 추출 하 고 microtubes에 추가 합니다. DNA의 손상을 방지 하려면 과도 한 자외선에 PCR 제품을 노출 하지 마십시오. 노출 시간을 30 이상 하지 s.</li>
	<li>앞에서 설명한3젤 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>4.5 단계에서 순화 된 DNA를 계량 fluorometry를 사용 하 여. 5 단계 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
</ol>5입니다. 황산 시퀀싱 라이브러리 준비
<ol><li>황산 변환 PCR 제품의 라이브러리 준비를 수행 합니다. 옵션:이 단계에서 PCR 제품 멀티플렉스할.</li>
	<li>최대 100을 사용 하 여 최종 복구 수행 PCR 제품의 ng. 0.2 mL 튜브에 55.5 µ L PCR 제품을 3 µ L 최종 준비 효소와 6.5 µ L 최종 수리 반응 버퍼 (10 배)를 추가 합니다. 장소 및 20 ° c에서 65 ° c.에 30 분 뒤 30 분에 대 한 열 cycler에 튜브를 품 어</li>
	<li>15 µ L 블런트/TA 리가 믹스, 2.5 µ L 최종 수리 DNA를 혼합 하 여 시퀀싱 어댑터 선 어댑터와 1 µ L 결 찰 증강. 사용 하는 경우 < 100 ng PCR 제품 입력으로 희석 어댑터 10 번.</li>
	<li>열 cycler에 믹스 (5.3 단계) 하 고 20 ° c.에서 15 분을 품 어 열 cycler 일시 중지 하 고 3 µ l 사용자 추가 튜브에 효소. 혼합 열 cycler에 다시 튜브를 배치 하 고 37 ° c.에서 15 분을 품 어</li>
	<li>크기는 DNA PCR 제품 크기에 따라 구슬의 다양 한 비율 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 비즈를 사용 하 여 어댑터 출혈 DNA를 선택 합니다.</li>
	<li>5.4 고 55 resuspended µ L SPRI 구슬에서 어댑터 출혈 DNA를 13.5 µ L H2O를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 5 분 및 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 솔루션은 분명, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬이 들어 있는 튜브를 삭제. 참고:는 상쾌한 어댑터 출혈 DNA를 포함 하 고 큰 원치 않는 조각을 폐기 구슬에 바인딩됩니다.</li>
	<li>단계의 5.6는 상쾌한에 25 µ L resuspended SPRI 구슬을 추가 하 고 섞어 실 온에서 5 분 동안 품 어. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명 하다는 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 폐기 상쾌한 어댑터 출혈 DNA 구슬에 바인딩되어 반면 원치 않는 DNA를 포함 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 실행 하는 동안 씻어 구슬 200 µ L 80% 에탄올 (갓 준비)를 추가 합니다. 품 어 30 s 및 제거와 삭제는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>공기 건조 구슬 5 분에 대 한 튜브 오픈 뚜껑 마그네틱 스탠드에 있는 동안.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 23 µ L 차입 버퍼에 DNA elute 혼합. 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명, 이전 PCR 증폭 (단계 5.14)에 대 한 96-잘 PCR 접시에 2 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>PCR 증폭 (단계 5.17)에 대 한 새로운 0.2 mL 튜브에 나머지 약 21 µ L를 전송. 참고: 해야 하지 어떤 구슬 구슬의 다음 단계 효소 반응 억제 수 있습니다 전송 합니다.</li>
	<li>단계 5.14 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
	<li>RT-정량 어댑터 출혈 DNA 증폭에 필요한 사이클 수를 예측 하 여 사전-PCR 증폭을 수행 합니다. 반응, 당 96 잘 PCR에서 다음 접시 포함 2 µ L DNA (단계 5.11) 추가: 0.4 µ L 인덱스 뇌관, 0.4 µ L 범용 PCR 뇌관, 7.2 µ L H2O, 10 µ L 실시간 정량 마스터 믹스.</li>
	<li>실시간 PCR 기계에 접시를 놓고 다음과 같은 조건에 접시를 주제: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 주기; 5 분 65 ° c.</li>
	<li>사전 증폭 RT-정량 PCR 반응의 선형 단계의 끝에 해당 Ct 값에 한 Ct 값을 빼서 각 샘플에 필요한 증폭 사이클의 수를 견적 한다.</li>
	<li>혼합 하 여 단계의 5.12 어댑터 출혈 DNA 증폭: 21 µ L DNA, 25 µ L PCR 마스터 혼합, 1 µ L 인덱스 뇌관, 1 µ L 범용 PCR 뇌관 및 2 µ L H2o. 열 cycler에서 다음과 같은 조건에 각 샘플 제목: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [5.16 단계에서 계산 된 Ct] 주기; 5 분 65 ° c. 참고:만 샘플 당 하나의 인덱스 뇌관을 사용 하 여 멀티플렉싱 있도록 기억 해요. 인덱스는 PCR 동안 삽입 됩니다.</li>
	<li>증폭된 DNA SPRI 구슬을 정화 하 고 22 µ L 차입 버퍼에 elute.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 또는 대체 방법으로 라이브러리 품질을 제어 합니다. 올바른 라이브러리 피크 크기 (PCR 제품 크기 플러스 어댑터)를 찾습니다.</li>
	<li>얼룩 분석 라이브러리 제품의 평균 기본적인 쌍 크기 예측: 고급 전역 설정을 두 번 클릭 "테이블"에 얼룩 분석에서. 100-1000 bp에서 영역을 정의 하 고 확인을 클릭 합니다. 지역 테이블에서 정의 된 지역 나타나고 라이브러리 평균 크기 (bp) 계산 됩니다.</li>
	<li>Fluorometry에 의해 라이브러리를 계량. 6 단계 또는-20 ° c.에 게 라이브러리를 진행</li>
</ol>6. 다음 세대 시퀀싱
<ol><li>수식을 사용 하 여 라이브러리의 nM 농도 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>라이브러리 같은 nM 농도 2 예 nM 희석 (선택 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 0.5 nM 라이브러리 농도 따라). 2 nM 라이브러리의 수영장을 달성 하기 위해 모든 라이브러리를 풀.</li>
	<li>변성 고 시퀀싱 악기 가이드 다음과 같은 라이브러리를 희석. 한마디로: 0.2 N NaOH 추가 하 여 2 nM 풀 변성 및 5 분 Dilute 오후 10의 최종 희석 변성된 풀에 대 한 실 온에서 품 어. 변성 고 오후 12 시 5의 최종 희석에 상용 컨트롤 라이브러리를 희석. 새로운 튜브 10 오후 수영장 20% 오후 12 시 5 컨트롤 라이브러리와 함께 혼합 한다. 참고: 황산 변환 매우 낮은 복잡성을 소개합니다. 20% 컨트롤 라이브러리 스파이크-에서 더 나은 품질의 시퀀싱 발생 합니다.</li>
	<li>깊은 시퀀싱 악기를 사용 하 여 150 bp 쌍-엔드 시퀀싱을 실행 합니다.</li>
</ol>7. 전산 분석-예상 메 틸 화 수준
<ol><li>.Fastq 파일 (sample1_R1.fastq.gz 및 sample1_R2.fastq.gz에 여기 라고 함)를 생성, 관심의 전체 게놈의 비스마르크 인덱스 생성 (여기에서 bismarkIndex라는 폴더) chrM의 게놈 시퀀스 fasta에 사용할 수 있는지 확인 하 고 형식 (여기서는 chrM라는 폴더에).</li>
	<li>어댑터 및 뇌관에 의해 소개 하는 바이어스를 제거에 전처리: Trim_galore33도구를 사용 하 여. 정방향 및 역방향 읽기의 5' 끝에서 2 개의 뉴클레오티드를 제거 합니다. trim_galore-clip_R1 2-clip_R2 2-o. /-쌍이 trim1-sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>전처리 된 읽기 비스마르크34 를 사용 하 여 전체 게놈에 정렬 비스마르크-사 개-빵-o. /. / bismarkIndex /-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz 참고: 다른 동기 기를 사용 하는 경우 고유 정렬 수 없습니다 읽기 삭제 됩니다 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>추출 읽고 염색체 M, Samtools35 를 사용 하 여 여기에 매핑 samtools 정렬-l 0-O BAM-o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools 인덱스 sample1_sorted.bam samtools 볼-u sample1_sorted.bam chrM | samtools 정렬-n-O BAM-o sample1_chrM.bam</li>
	<li>메 틸 화 정보 추출 bismark_methylation_extractor-p-cx는-cytosine_report-포괄적인-genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>.bedGraph는.cov 또는 CX_report.txt 파일을 사용 하 여 추가 분석을 위해. 시각화 및 테스트에 대 한 sample1_chrM.CX_report.txt 파일을 사용 합니다.</li>
	<li>수행 추가 전처리 단계에서 클리핑 영역이 여러 개를 심문 하 고 뇌관 바이어스 매핑 중 생성 M 바이어스 플롯에서 볼 수 있습니다. 자세한 내용은 대 한 비스마르크 설명서를 참조 하십시오.</li>
</ol>8. 전산 분석-차이의 테스트
<ol><li>CX_report.txt 파일 들어 염색체 M에 모든 c 7 열, 염색체 (여기 chrM), 위치, 스트랜드, 갠 읽기 수, unmethylated 읽기, C 컨텍스트 및 주변 시퀀스의 수를 확인 합니다.</li>
	<li>CX_report chrM 전체에서 커버, 증폭 되는 지구를 하위 집합을 확인 합니다.</li>
	<li>비 파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여 개별 c의 어 부의 정확한 테스트 등 전체 영역에 대 한 로그인 테스트 샘플 간의 차이 대 한. 참고: 정량화 될 것입니다 종종 0% 메 틸 화, 가까운 왜 정상 가정 적절 하지 않은 이유입니다.</li>
	<li>마찬가지로, 시각화, 시각화 quantiles 하거나 이항 비율 신뢰 간격을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 선언할 수 없습니다 경쟁 금융 관심 있다.

여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 ?...

미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 "황산 시퀀싱", 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA methylation-lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA chip</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit high sensitivity dsDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR detection system</td><td>Biorad&amp;nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.

이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.
제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.
<p class="jov...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

13.3K 조회수.  University of Copenhagen. 여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

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Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

연구

생물학

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

신경과학

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

생화학

mtDNA의 합성 및 분포에 대한 고처리량 정량화

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms has increased in recent years due to the recently developed ability to produce models by mtDNA mutagenesis and a new appreciation of the association between mitochondrial genetic aberrations and common age-related diseases such as cancer, diabetes, and dementia. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis technique that is widely employed across the mitochondrial field for routine genotyping experiments. Its relative affordability when compared to massive parallel sequencing methods and ease of implementation make it an invaluable technique in the field of mitochondrial genetics, allowing for the rapid quantification of heteroplasmy with increased flexibility. Despite the practicality of this method, its implementation as a means of mtDNA genotyping requires the observation of certain guidelines, specifically to avoid certain biases of biological or technical origin. This protocol outlines the necessary steps and precautions in designing and implementing pyrosequencing assays for use in the context of heteroplasmy measurement.

Pyrosequencing assays enable the robust and rapid genotyping of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms in heteroplasmic cells or tissues.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

요약

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Methylated DNA의 Immunoprecipitation

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석