이 기술은 크리켓의 배아 또는 애벌레 발달을 분석하도록 설계된 실험을위한 기본 방법 역할을합니다. 이 기술의 주요 장점은 유연하고 RNA 간섭 또는 게놈 조작을 활용하는 것과 같은 여러 유형의 실험 적 접근법을 지원할 것이라는 것입니다. 절차를 보여주는 것은 해들리 윌슨 호치, 실험실의 주요 조사자 입니다.
이 절차를 시작하려면 떨어지는 물로 베클러의 회전 분쇄기 평면을 적시다. 끌어온 바늘을 베벨러에 넣고 20도 각도로 바뀝니다. 바늘을 내리고 연삭 판에 닿을 때까지 2~3분 동안 구부립니다.
유리 현미경 슬라이드에 부착 된 이중 스틱 테이프에 beveled 바늘을 배치하여 bevel을 평가합니다. 카메라 및 이미지 수집 소프트웨어가 장착된 복합 현미경의 스테이지에 슬라이드를 놓습니다. 20배 의 목표를 사용하여 바늘의 이미지를 획득한다.
이미징 소프트웨어를 사용하여 바늘의 내부 루멘 직경을 측정하면 경솔한 개구부까지 의 근위만 을 측정합니다. 8 마이크로미터 보다 작은 개구부 또는 12 마이크로미터보다 큰 바늘을 버리십시오. 먼저, 물에 1%의 아가로즈 40밀리리터를 만들어 10센티미터 페트리 접시에 붓습니다.
아가로즈 표면에 달걀 우물 스탬프를 놓으면 고화됩니다. 아가로즈가 고화되면 스탬프를 제거하여 우물을 드러냅니다. 다음으로, 아가로즈웰 플레이트를 1%페니실린 연쇄상 구균증을 함유한 HBS로 채우는 다.
뚜껑을 접시에 놓고 파라필름에 싸서 섭씨 4도에 보관하십시오. 그 후, 35mm 페트리 접시에 흰색 놀이터 모래를 채우고 크리켓이 계란을 낳을 수있는 계란 컬렉션 요리를 만듭니다. 달걀 접시를 종이 타월 사각형으로 약 18 x 18센티미터로 자른 다.
종이 타월을 통해 수돗물로 채웁니다. 그런 다음 페트리 접시를 기울이고 윗쪽을 부드럽게 짜서 여분의 물을 제거합니다. 종이 타월 광장의 모서리를 접시 아래에 넣고 계란 접시를 거꾸로 된 뚜껑에 놓아 종이 타월을 제자리에 두십시오.
달걀 접시를 크리켓 쓰레기통에 넣고 성인 여성이 1 ~2 시간 동안 계란을 배란할 수 있도록하십시오. 한편, 아가로즈 접시를 실온으로 따뜻하게 하여 주사를 위해 계란을 들고 있는 것을 준비하십시오. 준비가 되면, 이제 크리켓 쓰레기통에서 갓 낳은 달걀을 함유한 달걀 수집 접시를 제거하십시오.
종이 타월을 제거하고 비커 위에 0.5~1밀리미터 크기의 모공 크기로 여과기를 놓습니다. 달걀 누워 접시의 내용을 부드럽게 흐르는 수돗물 아래 여과기에 헹구십시오. 모래 곡물은 스트레이너 메쉬를 통해 아래 비커에 떨어지고 크리켓 계란은 스트레이너 바구니에 남아 있습니다.
용기를 역삼투물로 채우고 트레이에 놓습니다. 용기 위에 여과기를 뒤집어 접시에 대고 달걀을 물에 빼넣습니다. 계란은 용기의 바닥에 가라 앉습니다.
다음으로 가위를 사용하여 P1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라 직경이 약 3밀리미터 들어 오도록 합니다. 이 팁을 P1000 파이프터에 놓고 용기에서 아가로즈 달걀 금형 접시로 계란을 옮기는 데 사용합니다. 플라스틱 핀셋을 사용하여 아가로즈 우물에 계란을 정렬합니다.
각 계란은 개인의 바닥에 잘 가라 앉습니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮어 주입할 준비가 될 때까지 덮습니다. 시작하려면, 해부 현미경 아래에 계란의 접시를 배치하고 약 10 배율의 낮은 배율을 선택합니다.
20 마이크로리터 로딩 팁과 P10 파이펫을 사용하여 1.5 마이크로리터의 사출 용액을 끌어내고 로딩 팁을 사출 바늘의 넓은 끝에 삽입합니다. 주입 용액을 주입 바늘로 추방하십시오. 바늘을 주입 하우징에 삽입하고 조여서 바늘이 제대로 되어 하우징에 단단히 삽입되도록 합니다.
그런 다음 조심스럽게 주입 하우징을 미세 조작기에 삽입하여 바늘에 의해 파손되거나 다치지 않도록 주의하십시오. 현미경을 통해 계란과 바늘을 모두 보는 동안, 접시 그리드의 왼쪽 상단 모서리에 있는 X 근처 바늘을 이동합니다. 팁이 HBS에 들어갈 때까지 바늘을 낮추고 페니실린 연쇄절제술을 완화한 용액을 접시에 넣습니다.
시현의 바늘을 중앙에 두고 달걀 접시를 움직여 바늘이 계란보다 접시 가장자리에 몇 밀리미터 더 가깝습니다. 이 후, 로다민에 적합한 필터로 현미경을 설정하여 바늘의 형광을 관찰하고 팁에 집중하십시오. 마이크로인젝터에서 주입 용액이 바늘에서 서스펜션 용액으로 누출되기 시작할 때까지 천천히 균형 노브를 시계 방향으로 돌립니다.
그런 다음 염료가 바늘에서 누출되는 것을 멈출 때까지 노브를 시계 반대 방향으로 약간 돌려보세요. 바늘이 여전히 시야에 중심을 두고 있는 상황에서 계란 접시를 움직여 바늘이 먼저 주입되는 계란을 겨냥하도록 합니다. 배율을 약 50배로 조정하여 단일 계란이 대부분의 시야를 채웁니다.
마이크로 조작기와 달걀 접시에 손을 모두 사용하여 바늘을 주사의 위치로 이동시킵니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 전진시키고 주입할 첫 번째 계란에 팁을 삽입하여 계란의 뒤쪽 끝에서 계란 길이의 20~30%에 바늘을 삽입하여 계란의 긴 축에 수직으로 삽입하십시오. 주입 발 페달 또는 마이크로 인젝터의 주입 버튼중 하나와 솔루션을 주입.
계란 내부형 물질의 작은 bolus 성공적인 주사를 나타냅니다. 그 후, 계란에서 바늘을 철회. 바늘을 철회할 때 계란이 의도치 않게 우물에서 들어 올린 경우 작은 집게를 사용하여 바늘을 철회하면서 계란을 우물로 밀어 넣습니다.
이 연구에서, 크리켓 계란은 RNA 간섭 및 게놈 조작을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 실험에서 기초적인 방법으로 작용하는 기술을 사용하여 주입됩니다. 생존율은 이 실험의 성공을 평가하기 위한 중요한 매개변수 중 하나입니다. 대부분의 죽은 계란은 쉽게 계란 내의 노른자와 배아 조직이 고르지 뭉치기 시작하고, 결국 노른자의 대부분이 계란의 한쪽으로 이동하기 때문에 시력에 의해 쉽게 식별 될 수 있습니다.
4~6일 후에 평가될 때, 주입되지 않은 계란의 85% 이상은 살아남았고, 실험용 시약으로 주입된 계란은 일반적으로 더 낮은 생존율을 보였습니다. 주사 자체의 모든 측면에 대한 제어, 바늘 펑크를 포함, 염료 및 버퍼의 도입, 또는 차량 또는 이중 좌초 RNA의 존재, 실험 조작 시도의 진정한 효과를 이해하기 위해 요구된다. 주사의 현상 결과를 평가하는 방법은 주입된 것에 달려 있습니다.
예를 들어, 특정 mRNA 녹다운의 결과로 표형 변화는 총 해부학 수준에서 명백할 수 있다. 한편, EGFP를 코딩하는 cDNA가 G.bimaculatus 액틴 프로모터의 제어하에 히스톤 2B 유전자를 태그한 경우 피기백 트랜스포사제를 사용하여 크리켓 게놈에 삽입되며, EGFP 태그히스트 2B 단백질을 자극하기 위해 형광을 사용하여 계란내각 핵을 시각화할 수 있게 된다. 바늘이 막히지 않도록 균형을 조정하는 것은이 절차에서 중요한 단계입니다.
노른자가 때때로 바늘 팁을 막히기 때문에 후속 주사 후 몇 가지 조정을해야 할 수도 있습니다. 크리켓은 드로소필라와 같은 홀로메타볼루곤충을 잘 연구하기 위해 분주하게 가지는 간질 곤충입니다. 크리켓 개발을 공부하는 것은 우리가 동물의 왕국을 가로 질러 진화와 개발에 대한 자세한 이해도움이 될 것입니다.
이 기술은 몇 가지 연습을 합니다. 주사 후 4~5일 생존율이 최소 80%가 될 때까지 제어 주사를 연습하는 것이 좋습니다.
