TRAP-seq를 사용하면, 우리는 그 세포에서 발생하는 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 부상당한 간에서 다시 채우는 간세포와 같은 특정 세포 유형으로부터 RNA를 분리할 수 있습니다. 그것은 조직에서 원치 않는 세포를 제거하는 어떤 단계를 필요로하지 않습니다. 세포 유형별 RNA는 전체 장기 용해로부터의 친화성 정화에 의해 격리된다.
이 기술은 우리가 특정 세포가 상해에 어떻게 반응하는지 결정하는 것을 돕습니다, 이는 간 질병을 싸우기 위하여 새로운 전략 또는 약을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 간 세포 간 부상의 다른 종류에 응답 하는 방법을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 현재, 심각한 급성 간 부상에 대 한 몇 가지 옵션이 있으며이 방법은 새로운 치료에 우리를 단서 하는 데 도움이 될 것입니다.
이 방법은 뇌에서 유래. 간에서, 우리는 몇몇 이름을 하기 위하여 세포 모형, 간세포, 담즙 덕트 세포, Kupffer 세포 및 내피 세포의 다이내믹한 변경을 검토하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 구상했습니다. 절차를 시연하는 것은 앰버 왕, 대학원생 및 내 멘티가 될 것입니다.
시작하려면 부드러운 파이펫팅으로 자기 구슬을 다시 중단합니다. 자기 스탠드에서 구슬을 1분 이상 수집하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 자기 스탠드에서 미세 원심 분리기를 제거하고 PBS의 1 밀리리터를 넣고 구슬을 씻기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 다시 배치하여 구슬을 수집하고 PBS를 제거합니다. 단백질 L 코팅 구슬을 준비하려면 16 마이크로리터의 바이오티니드 단백질 L을 재일시 및 세척된 마그네틱 비즈에 추가하고 1.5밀리리터 미세 센트리슈지 튜브 또는 1.5 밀리리터를 사용하는 경우 1X PBS를 추가하여 2밀리리터 미세 심선 분리기를 사용하는 경우 최종 볼륨을 1밀리리터로 만듭니다. 자기 구슬을 생체개화 단백질 L로 배양하여 튜브 회전기의 실온에서 35분 간 배양합니다.
그런 다음, 튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 놓고 상체를 제거하여 단백질 L-코팅 구슬을 수집합니다. 마그네틱 스탠드에서 마이크로센심심분리기 튜브를 제거하고 3%BSA 버퍼로 PBS 1밀리리터를 추가한 다음, 단백질 L 코팅 구슬을 세척하기 위해 최소 5회 이상 부드러운 파이펫을 넣습니다. 다시 말하지만, 튜브를 자기 스탠드에 1 분 이상 놓고 코팅 된 구슬을 수집하기 위해 상체를 제거하십시오.
BSA세탁을 4번 더 반복합니다. 다음으로, GFP 항체 19C8 및 GFP 항체 19F7을 위한 항체 50 마이크로그램을 단백질 L 코팅 구슬에 각각 추가하고, 튜브 회전기에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한다. 친화성 매트릭스를 수집하려면 튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 배치하고 상체를 제거합니다.
자기 스탠드에서 튜브를 가져 와서 저염 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오. 상하로 부드럽게 파이프를 사용하여 선호도 매트릭스를 세척하고 저염 버퍼를 두 번 더 세척합니다. 200 마이크로리터의 저염 완충제에서 구슬을 재연하여 200마이크로리터의 친화성 매트릭스를 만듭니다.
먼저, PTFE 유리 튜브가 균질화 중에 얼음위에 배치될 수 있도록 조직 분쇄기를 설치합니다. PTFE 유리 튜브에 차가운 리시스 버퍼 4밀리리터를 채웁니다. 페트리 접시에 간을 놓습니다.
칼을 사용하여 200~500밀리그램의 간 조각을 분리하고 PTFE 유리 튜브로 이동합니다. 나머지 간 조직을 미리 차가운 미세 원심 분리튜브에 넣고 액체 질소에 플래시 동결하십시오. 간 구조에서 간세포화하기 위해 적어도 5개의 뇌졸중을 위해 300rpm부터 시작하여 모터 구동 균질화로 샘플을 균질화합니다.
매번 유리 튜브를 낮춥습니다. 유봉을 용액 아래에 두어 단백질 변포화를 일으킬 수 있는 폭합을 방지하십시오. 그런 다음, 속도를 900 rpm으로 올려 적어도 12개의 전체 스트로크에 대한 간 조직을 완전히 균질화합니다.
용해를 라벨과 미리 차가운 튜브로 옮기고 1밀리리터 이하의 용하가 없습니다. 핵 용액을 시작하려면 간 용액을 섭리 2, 000 g에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 얼음에 있는 새로운 미리 차가운 미세 원심 분리 튜브로 상체를 옮긴다. 얼음의 미세 원심 분리튜브에 10%NP-40의 상체 부피의 1/9을 넣고 튜브를 부드럽게 반전시켜 용액을 혼합합니다.
마이크로원심분리기 튜브를 미니 원심분리기로 빠르게 회전시키고 10%DOC의 시료 부피의 1/9을 추가합니다. 원심분리기핵은 섭씨 4도에서 20배, 000배, 얼음 위에 차가운 미세센심분리기 튜브로 상전자관을 옮긴다.
각 튜브에 대해, 면역 전 침전 대조군으로서 상체의 총 부피의 1%를 꺼내십시오. 하룻밤 사이에 튜브 회전기에 면역 강수전 제어를 배치합니다. 파이펫팅을 통해 선호도 매트릭스를 부드럽게 다시 한 번 반복한 다음 각 샘플에 200 마이크로리터를 추가하십시오.
하룻밤 사이에 4도에서 튜브 회전기에서 부드러운 혼합으로 lysates를 배양합니다. RNA를 분리하려면 미니 원심분리기에 용액이 들어 있는 튜브를 빠르게 회전시키고 적어도 1분 동안 자기 랙에 배치하여 구슬을 수집합니다. 추가 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집합니다.
각 튜브에 신선한 고염 버퍼 1밀리리터를 넣고 거품을 도입하지 않고 최소 5회 이상 부드러운 파이펫을 넣습니다. 얼음위에 있는 마그네틱 스탠드의 구슬을 1분 이상 모아 상수포를 제거합니다. 세탁 단계를 4번 더 반복합니다.
그런 다음 자기 스탠드에서 미세 원심 분리기를 제거하고 실온에서 5 분 동안 데워지지 않습니다. 비드를 100 마이크로리터의 용액 버퍼에 베타-메카토에탄올의 0.7 마이크로리터로 재연하여 친화성 매트릭스로부터 바운드 RNA를 방출한다. 가장 빠른 속도로 적어도 5초 동안 튜브를 소용돌이쳐 빠르게 회전합니다.
그런 다음 실온에서 튜브를 10 분 동안 배양하십시오. 자기 스탠드에 튜브를 1분 이상 놓고, 상체를 수집한 다음 키트내RNA 정화 프로토콜에 따라 RNA 정화로 즉시 진행한다. 절연 된 RNA의 최대 품질을 달성하기 위해, DNase 소화 및 60 섭씨에 용출 버퍼의 권장 예열을 포함하여 모든 RNA 용출 단계를 포함한 모든 선택적 단계를 수행.
이 연구에서는, GFP-L10A 융합 및 Fah transgenes는 유체 역학 주입에 의해 간으로 트랜스포슨 함유 플라스미드 트랩 벡터 내에서 공동 전달되었다. 니티시네온의 제거는 독성 간 손상을 유도. 면역형광 염색은 FAH 및 GFP-L10A 융합 단백질및 간 재채우기 2주 후에 재채우기 간세포의 공동 발현을 확인했습니다.
모든 간세포가 AAV8-TBG-Cre 주입 후 GFP-L10A를 발현하기 때문에 정지 성 샘플은 퓨전 단백질의 가장 높은 수율을 생산했습니다. 반대로, 거의 모든 RNA는 GFP-L10A 트랜스진이 없는 야생형 대조군에서 검출가능했으며, 이는 TRAP 절차가 매우 특이적이며 배경이 낮다는 것을 나타낸다. TRAP이 GFP-L10A로 재구를 겪고 있는 간 조직에 사용되었을 때 간세포로 변형된 풍부한 고품질 RNA를 얻었다.
대조적으로, 부정적인 대조군 견본을 위한 Bioanalyzer를 통해 RNA 추적이 검출되지 않았습니다. Gsta1 발현은 정지 성 간세포에 비해 간구를 다시 채우는 데 10배 이상 유도되었으며, 입력 RNA의 부족으로 인해 야생형 마우스로부터 TRAP 절연 RNA로 임계값 사이클 값이 검출되지 않았다. 조직을 균질화 할 때, 폭기를 방지하기 위해 천천히 유봉을 이동해야합니다.
RNA를 격리한 후, 고처리량 시퀀싱 또는 qPCR은 유전자 발현을 분석하기 위해 수행될 수 있다. TRAP-seq를 사용하면 간세포를 다시 채우는 RNA를 구체적으로 분리하고 간 재인구 중 유전자 발현의 변화를 분석하는 방법이 있습니다. 이것은 우리가 간 상해의 처리를 위한 이 프로세스 및 잠재적인 치료 표적 도중 변경되는 유전자를 확인하는 것을 허용합니다.
여러 완충제에 존재하는 사이클로헤시미드와 DTT는 모두 독성이 있다. 폐기물은 제도적 지침에 따라 수거및 폐기해야 합니다.
